[自然科學(xué)]干擾素的生產(chǎn)與行(編輯修改稿)
2025-02-15 10:23 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 個(gè)小時(shí) 無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品 純化過程：淘汰抗體親和層析 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝 3 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝 、基因工程假單胞桿菌菌種建立 ? 第一步：干擾素 α2b基因的克隆 ? 第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 第三步：工程菌的構(gòu)建 第一步：干擾素基因的克隆 (RTPCR) ? 制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離 mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR， ? 基因連接質(zhì)粒 , 轉(zhuǎn)化 ,篩選鑒定克隆。 ? 測(cè)序：編碼人 IFNα 2b基因序列 ,501bp， 165aa。 第二步：表達(dá)載體構(gòu)建 ? IFN基因與表達(dá)載體連接 ? 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ? 篩選陽(yáng)性克隆 ? 獲得序列正確表達(dá)載體 第三步：工程菌構(gòu)建 ? 轉(zhuǎn)化假單胞桿 ? 篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌 ? 獲得原始菌種 干擾素 α2b的發(fā)酵工藝過程 （ 1） 搖瓶培養(yǎng) ? 取保存工作種子批菌種，室溫融化 ? 搖瓶培養(yǎng)： 30℃ ， ， 250 r/min， 18177。 2h ? 檢測(cè)： OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。 （ 2）種子罐培養(yǎng) ? 接種：接入 50L種子罐，接種量 10%。 ? 培養(yǎng)： 30℃ ， 。 ? 控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO為 30%， 3～ 4h， OD。 ? 檢測(cè)：顯微鏡和 LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。 （ 3）發(fā)酵罐培養(yǎng) ◆ 接種：通入 300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量 10%。 ? 控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。 ? 前 4h： 30℃ ， ， DO為 30%。 ? 4h后： 20℃ ， ， DO為 60%， 5～ 。 ? 終點(diǎn)控制： OD值達(dá) 177。 ， 5℃ 冷卻水快速降溫至 15℃ 以下。 ? 檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查 （ 4）菌體收集 ? 連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液， 16000 r/min離心收集。 ? 菌體保存：－ 20℃ 冰柜，不超過 12個(gè)月。 ? 檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。 干擾素的分離純化工藝過程 、干擾素分離工藝過程 、干擾素的純化工藝過程 干擾素 α2b分離工藝過程 ? 菌體裂解 ? 預(yù)處理 ? 初級(jí)分離 (1)菌體裂解 ? 裂解緩沖液：純化水配制， 2℃ ～ 10℃ （ ） ? 使用保護(hù)劑： EDTA， PMSF。 ? 破碎－ 20℃ 菌體： 2厘米以下的碎塊 ? 攪拌：加裂解緩沖液， 2℃ ～ 10℃ ， 2hr ? 凍融 : 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。 (2)預(yù)處理 沉淀 ? 加絮凝劑聚乙烯亞胺 : 2℃ ～ 10℃ ，攪拌 45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。 ? 加凝聚劑醋酸鈣溶液 : 2℃ ～ 10℃ ,攪拌 15min，對(duì)菌體碎片、 DNA等進(jìn)行沉淀。 (3)離心 ? 連續(xù)流離心機(jī)： 2℃ ～ 10℃
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