【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 換為胸腺嘧啶，可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感，所以在PCR擴(kuò)增前對(duì)新配制的反應(yīng)物用UDG處理以降解交叉污染的PCR產(chǎn)物，而不降解要擴(kuò)增的基因組DNA模板，然后熱滅活此酶，再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。十、PCR的種類(lèi)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR的種類(lèi)越來(lái)越多，不勝枚舉，由于篇幅所限這里不一一列舉。十一、PCR的應(yīng)用領(lǐng)域生物學(xué)領(lǐng)域：幾乎無(wú)處不用，基因、DNA片段的克隆；人工基因構(gòu)建；DNA序列測(cè)定；基因定點(diǎn)突變；基因型（突變）檢測(cè)；SNP分析，遺傳背景分析；生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究；基因表達(dá)量研究（realtime PCR）/ 基因表達(dá)譜研究（ DNA chip）醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：疾病基因檢測(cè) / 遺傳病的產(chǎn)前診斷；致病病原體的檢測(cè)；腫瘤治療中癌基因的檢測(cè)；會(huì)推廣到大部分疾病治療前的檢測(cè)；DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證；其他: 動(dòng)、植物檢疫（轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)） 獸醫(yī)方面：四大動(dòng)物疫?。∟D、FMD、HPAV、CSF）；除此之外的大多數(shù)動(dòng)物病毒性疫??；部分動(dòng)物細(xì)菌性疫病。十二、結(jié)語(yǔ)PCR經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，已成為當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域舉足輕重的實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際應(yīng)用技術(shù)，近年來(lái)發(fā)明的熒光定量PCR使得PCR更為簡(jiǎn)便、快速，將來(lái)會(huì)進(jìn)展成什么樣很難說(shuō)，但有一點(diǎn)可以肯定，PCR技術(shù)永遠(yuǎn)是分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)手段之一。同時(shí)，PCR技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)該也將越來(lái)越廣泛，會(huì)成為我們?nèi)粘z測(cè)的主要技術(shù)。藍(lán)耳病病原檢測(cè)方法 豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一種傳染病，妊娠母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，仔豬以呼吸系統(tǒng)疾病為特征。該病分布廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類(lèi)動(dòng)物疾病，上世紀(jì)90年代該病傳入我國(guó)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見(jiàn)DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法可以檢測(cè)到普通藍(lán)耳病病毒以及變異株藍(lán)耳病病毒，檢測(cè)到陽(yáng)性后可以采用變異株藍(lán)耳病病毒RTPCR方法進(jìn)一步檢測(cè)是否是變異株。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RTPCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱(chēng)量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：取豬肺、扁桃體、腦等組織及血清，4℃或低溫保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。病料采集要新鮮，最好采集病變與健康臨界部位。樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心5min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混勻。血清樣品的處理：取血清100ul，加入300ul消化液，混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照處理：取陰性/陽(yáng)性對(duì)照100ul，加入300ul消化液，混勻。RNA提取：處理好的樣品，每管依次加入醋酸鈉溶液30ul，酚/氯仿/異戊醇混合液300ul，顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000rpm離心15min。，加入300ul異丙醇，混勻，置液氮3min或70℃30min，室溫融化，4℃15000rpm離心20min。棄去上清，沿管壁緩緩加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCR、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的樣品RNA于PCR管中，在PCR儀中進(jìn)行如下循環(huán)：42℃45min，94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。電泳觀察結(jié)果：稱(chēng)取2g瓊脂糖于100ml1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)660bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)660bp擴(kuò)增帶為PRRSV陽(yáng)性，否則為陰性。 高致病性藍(lán)耳病病原檢測(cè)方法 高致病性藍(lán)耳病(PRRS)是由藍(lán)耳病變異株引起的的一種急性的傳染病，2006年6月開(kāi)始在江蘇、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、河南等地發(fā)生并流行，截至到2007年6月，我國(guó)已經(jīng)有22個(gè)省市發(fā)生高致病性藍(lán)耳病。主要引起豬的發(fā)燒、厭食或不食、眼結(jié)膜炎、咳嗽、喘等呼吸道癥狀，后驅(qū)無(wú)力、不能站立或搖擺等神經(jīng)癥狀。變異株藍(lán)耳病傳染性強(qiáng)，流行期長(zhǎng)，在一個(gè)地區(qū)內(nèi)遷延數(shù)月無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，常規(guī)治療無(wú)明顯療效。發(fā)病豬部分年齡段均出現(xiàn)急性死亡。變異株藍(lán)耳病病毒與國(guó)外其他分離株相比，在NSP2的481和532～560位氨基酸缺失（共缺失30個(gè)氨基酸）。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見(jiàn)DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法在藍(lán)耳病NSP2變異區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)高致病性藍(lán)耳病進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)普通株藍(lán)耳病不能進(jìn)行檢測(cè)，與通用藍(lán)耳病RTPCR試劑盒配合使用。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、RNA酶抑制劑、PCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱(chēng)量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：取豬肺、扁桃體、腦等組織及血清，4℃或低溫保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。病料采集要新鮮，最好采集病變與健康臨界部位。樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心5min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混勻。血清樣品的處理：取血清100ul，加入300ul消化液，混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照處理：取陰性/陽(yáng)性對(duì)照100ul，加入300ul消化液，混勻。RNA提?。禾幚砗玫臉悠?，每管依次加入醋酸鈉溶液30ul，酚/氯仿/異戊醇混合液300ul，顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000rpm離心15min。，加入300ul異丙醇，混勻，置液氮3min或70℃30min，室溫融化，4℃15000rpm離心20min。棄去上清，沿管壁緩緩加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCRRT（反轉(zhuǎn)錄）：取16ul反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、1ulRNA酶抑制劑、1ul反轉(zhuǎn)錄酶、2ul提取的病毒RNA，混勻后，作好標(biāo)記，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：42℃60min、98℃5min。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）：取16ulPCR反應(yīng)液、2ulTaqDNA聚合酶、2ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，混勻，作好標(biāo)記，在PCR儀上進(jìn)行以下循環(huán)：94℃30sec、55℃30sec、72℃sec、35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。電泳觀察結(jié)果：稱(chēng)取2g瓊脂糖于100ml1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為PRRSV（NSP2 1594～1680變異株）陽(yáng)性，否則為陰性。口蹄疫RTPCR檢測(cè)方法概況口蹄疫（Foot and Mouth Disease ，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性、烈性傳染病，其臨床表現(xiàn)以口腔粘膜、舌面、鼻鏡、蹄部、乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征。一旦發(fā)生，會(huì)對(duì)發(fā)生國(guó)的經(jīng)濟(jì)、政治造成巨大影響，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和我國(guó)政府均將該病列為A類(lèi)動(dòng)物傳染病?？谔阋卟≡瓩z測(cè)方法：用途：口蹄疫反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR），用于檢測(cè)疑似感染動(dòng)物水皰皮或水皰液中所有血清型口蹄疫病毒，適用于口蹄疫病毒的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見(jiàn)DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法可以檢測(cè)所有亞型的口蹄疫病毒，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，需進(jìn)一步采用分型診斷試劑盒進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RTPCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱(chēng)量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：病死或撲殺的偶蹄動(dòng)物，取潰爛或潰瘍的表皮組織等；待檢的活動(dòng)物取水皰皮或水皰液置于5ml50%甘油生理鹽水中。(2～8℃)保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料）樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心2min，取上清100ul，再加入3