環(huán)境微生物學(xué)第1章病毒(編輯修改稿)
2025-02-12 09:54 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 λ代表溶原性噬菌體 。 四、 病毒的測定與培養(yǎng)（自學(xué)） ?病毒的測定 ?病毒顆粒計(jì)數(shù)法 ?間接計(jì)數(shù)法 ?病毒感染效價(jià)測定法 （一）病毒的測定 病毒顆粒計(jì)數(shù)法 ? 用 電子顯微鏡直接計(jì)數(shù) 。用于已知形態(tài)病毒的濃縮樣品的計(jì)數(shù)。 ? 測定方法 ： 將病毒樣品與已知濃度的乳膠小顆粒均勻混合，然后將混合液均勻噴灑在已包被的樣品方格網(wǎng)上，分別計(jì)乳膠顆粒和病毒顆粒數(shù)目。病毒的濃度可由樣品中兩種顆粒的比例和乳膠顆粒濃度計(jì)算得出。 間接計(jì)數(shù)法 ?血細(xì)胞凝集試驗(yàn) （ hemagglutination assay）計(jì)數(shù) ?測定方法 ： 分別將紅細(xì)胞與一系列 10倍稀釋的病毒樣品混合，再觀察結(jié)果。以能引起血細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)（或稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）為病毒的效價(jià)。 病毒感染效價(jià)測定法 ? 病毒感染效價(jià)測定法與病毒培養(yǎng)方法基本相同。 （二）病毒的培養(yǎng)特征 病毒在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征 將噬菌體的敏感細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后敏感細(xì)菌均勻分布在培養(yǎng)基中而使培養(yǎng)基渾濁。然后接種噬菌體，敏感細(xì)菌被噬菌體感染后發(fā)生菌體裂解， 原來渾濁的細(xì)菌懸液變成透明的裂解溶液 。 噬菌體在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征 病毒在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征 將噬菌體的敏感細(xì)菌接種在瓊脂固體培養(yǎng)基上生長，形成許多個菌落，當(dāng)接種稀釋適度的噬菌體懸液后引起點(diǎn)性感染，在感染點(diǎn)上進(jìn)行反復(fù)的感染過程，宿主細(xì)菌菌落就一個個地被裂解成一個個空斑，這些空斑就叫 噬菌斑 。 噬菌體在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征 ， 噬菌斑 （三）病毒的培養(yǎng)基 病毒的培養(yǎng)基應(yīng)具備的條件： ① 必須是 活 的敏感動物或是活的敏感動物組織細(xì)胞； ② 能提供病毒附著的 受體 ； ③ 敏感細(xì)胞內(nèi) 沒有破壞特異性病毒的限制性核酸內(nèi)切酶 ，病毒進(jìn)入細(xì)胞就可增殖。 ① 人胚組織細(xì)胞 ② 人組織細(xì)胞 ③ 人腫瘤細(xì)胞 ④ 動物組織細(xì)胞 ⑤ 雞 、 鴨胚細(xì)胞 ⑥ 敏感動物 與相應(yīng)的敏感植株和敏感的植物組織 。 與噬菌體相應(yīng)的敏感細(xì)菌 ， 如大腸桿菌噬菌體用大腸桿菌培養(yǎng) 。 （四）病毒的培養(yǎng) 病毒樣品的采集與制備 病毒存在于動 、 植物病灶組織 、 體液 、 分泌物 、 糞便 、 下水污泥 、 活性污泥 、 污水 、 河水 、 湖水 、 海水等處 。 固體病毒樣品 采得后 ， 加液體培養(yǎng)基制成懸液 ， 以 10000 r/min 離心 10 min， 去除雜質(zhì) ， 取其上清液備用 。 液體病毒樣品 直接以 10000 r/min離心 10 min， 去雜質(zhì) ， 取其上清液備用 。 空氣病毒樣品 采用真空泵抽取至長有宿主菌的平板上 ， 或是將長有宿主菌的平板打開蓋 ， 在空氣中暴露 30～ 60 min以收集 。 若樣品中病毒濃度大則要適當(dāng)稀釋 ， 若樣品中的病毒濃度小則要濃縮 。 動物病毒的培養(yǎng)： 動物病毒的空斑試驗(yàn) ?(1)單層細(xì)胞的制備和培養(yǎng)： 用無菌小刀將動物組織切成 ～ 1mm3的小塊，用平衡鹽溶液 (Hank39。s或 Earle39。s)洗滌數(shù)次，加體積分?jǐn)?shù) 5％胰酶消化 10～15min(有的消化時間長至 30min，甚至十幾小時 )，將細(xì)胞間的“間質(zhì)蛋白”水解，使細(xì)胞分散，將胰酶沖洗掉，吹散細(xì)胞并計(jì)數(shù)。加入含牛血清的生長液，分裝，保持 37℃ 溫度，培養(yǎng) 2～ 3d即長成單層細(xì)胞，以備培養(yǎng)病毒用。還可經(jīng)傳代后再培養(yǎng)病毒。 (2) 動物病毒的接種與觀察 ① 將病毒懸液置于單層細(xì)胞的表面 ， 經(jīng)適當(dāng)時間孵育 ， 使病毒最大限度地吸附在宿主細(xì)胞上 。 ② 將軟瓊脂或羧甲基纖維素注入鋪在單層細(xì)胞表面 ， 經(jīng)過一定時間培養(yǎng) ， 結(jié)果在單層細(xì)胞上呈現(xiàn)出空斑 。 ③ 以出現(xiàn)的空斑數(shù)判斷病毒數(shù) ηPFU（ 病毒空斑單位 ） 。 噬菌體的培養(yǎng)和測定 ? 噬菌體的效價(jià) 即 1mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。效價(jià)的測定一般采用 雙層瓊
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