【文章內(nèi)容簡介】 和 ColEl是大腸桿菌的兩種質(zhì)粒。pSCl01和 ColEl結(jié)合起來的質(zhì)粒稱為 pSCl34。 ? 在具有正常的 DNA聚合酶 I的細(xì)菌 (CR34polAl+和C600polAl+)中， pSCl01可進(jìn)行正常的復(fù)制，每一細(xì)胞中可產(chǎn)生相當(dāng)于每一染色體的 pSCl01質(zhì)粒 5個(gè)，它所帶有的四環(huán)素抗藥性因子使宿主細(xì)胞所呈現(xiàn)的抗藥性為 2530單位／ ml。 ? ColEl和 pSC101能夠并存在同一細(xì)胞中，作為屬于不同的不親和群的兩個(gè)質(zhì)粒，它們的復(fù)制彼此不相干擾，每一細(xì)胞的質(zhì)粒數(shù)是兩者之和。 ? 只有 pSCl01帶有四環(huán)素抗性基因，所以帶有這兩種質(zhì)粒的細(xì)菌的抗藥性并不因?yàn)橘|(zhì)粒的總數(shù)的增加而提高。 ? pSCl34在有或沒有正常的 DNA聚合酶的宿主中的行為不同。在 DNA聚合酶 I發(fā)生缺陷的宿主 W3110polAl)中它的行為不論從質(zhì)粒數(shù)、抗藥性和電子顯微鏡下觀察到的復(fù)制開始部位來看都和 pSCl01相同，但是在 DNA聚合酶正常的宿主細(xì)菌中這些行為則都和 ColEl相同。 ? 在 pSCl34中 pSCl01的復(fù)制為 ColEl所帶動，所以它的 16個(gè)質(zhì)粒上都帶有抗性基因，因而宿主細(xì)菌的抗藥性也大大地提高了。 七、質(zhì)粒的穩(wěn)定性 質(zhì)粒遺傳的穩(wěn)定性： ?質(zhì)粒應(yīng)在細(xì)胞分裂前復(fù)制，然后 均等 地分配到子代細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒遺傳的穩(wěn)定性。 某些質(zhì)粒（ F、 Rl和 pSC101）中發(fā)現(xiàn)有 par基因， 參與質(zhì)粒在細(xì)胞分裂時(shí)的分配作用 。 Par稱分配區(qū)。 不同類型質(zhì)粒間的 par基因在功能上可以互補(bǔ) ，如丟失了 par基因的 R1質(zhì)粒，可因獲得了來自 pSC101的 par基因，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒在分配上的穩(wěn)定性。 沒有 par基因的高拷貝質(zhì)粒ColE1依賴于 質(zhì)粒的隨機(jī)分配 來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂過程中的穩(wěn)定性。 在某些情況下， ColE1能彼此重組而形成多聚體（ multirner）， 使單個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)減少，增加無質(zhì)粒子細(xì)胞的產(chǎn)生。 沒有 par基因的質(zhì)粒的隨機(jī)分配 無質(zhì)粒子細(xì)胞 ColE1質(zhì)粒上有 cer基因?qū)ｉT負(fù)責(zé) 多聚體的解聚 作用，能使之重新轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w質(zhì)粒。 某些質(zhì)粒還通過在無質(zhì)粒細(xì)胞中編碼產(chǎn)生特殊的 致死蛋白（ 殺死 無質(zhì)粒子 細(xì)胞 ） 來保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 一般含有質(zhì)粒的細(xì)胞的生長速度低于無質(zhì)粒細(xì)胞， 在相同條件下混合培養(yǎng)時(shí)，含質(zhì)粒細(xì)胞所占的比例將逐漸下降 . 八、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 質(zhì)粒根據(jù)其轉(zhuǎn)移性可分為轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性兩大類型。 ★轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒 ? 大腸桿菌的 F質(zhì)粒、 Rl、 R100、 Co1V、ColIb－ R6K、 RP4 ? 天藍(lán)色鏈霉菌 pSCP豌豆根瘤菌 pJ5JI等。 ? 轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒多是 低拷貝的大質(zhì)粒 . ? 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒多是 多拷貝的小質(zhì)粒 ,大多數(shù)細(xì)菌素質(zhì)粒 . 2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移受到限制修飾系統(tǒng)的影響 ? 轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒在同一種細(xì)菌間轉(zhuǎn)移時(shí)不為限制酶所分解，因?yàn)樗厝灰呀?jīng)被修飾，如果由一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌則常受限制。 ? 沒有限制作用的宿主細(xì)菌如大腸桿菌 C容易接受噬菌體的感染，也容易接受質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。 ? 限制缺陷型 (restrictionless， r)宿主可由原來不易接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的狀態(tài)變?yōu)槿菀捉邮苻D(zhuǎn)移的狀態(tài)。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 1)自主轉(zhuǎn)移 ★ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移從 oriT(DNA轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn) )開始 。 在轉(zhuǎn)移的同時(shí)進(jìn)行復(fù)制 。 ★ F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移只能在 相同 或 相近 的供 、受體菌細(xì)胞之間進(jìn)行 。 ★許多 R質(zhì)粒由于 含有轉(zhuǎn)移操縱子和抗性基因 ，能在較廣的宿主范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移。 2) 誘動轉(zhuǎn)移 ★ 誘動轉(zhuǎn)移 ： ColE1和 RSF1010等小質(zhì)粒由于缺少轉(zhuǎn)移基因而不能自主轉(zhuǎn)移 ， 但由于它們含有 bom位點(diǎn) （ 與 F質(zhì)粒的 oriT類似 ） 或誘動基因 mob, 因而能夠被帶有 tra基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒如 F質(zhì)粒等誘動轉(zhuǎn)移 . ★ 例 :以同時(shí)含有 F和 ColE1質(zhì)粒的Ecoli為供體菌 ， 對 F菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn) . ★ 90％ 以上獲得 ColE1質(zhì)粒的受體菌為 F+， 5％ 以上獲得 ColE1質(zhì)粒的受體菌為 F， ★ 誘動轉(zhuǎn)移不一定需要 F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移 。 ★ 誘動轉(zhuǎn)移過程： ☆ 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒在 松弛蛋白 （誘動基因 mob編碼）作用下解旋開始 ☆核酸 內(nèi)切酶在 bom位點(diǎn)處將質(zhì)粒一條單鏈切成開鏈環(huán)狀。 ☆ 松弛蛋白在單鏈切口 5＇ 端結(jié)合作為引導(dǎo)蛋白。 ☆ 在 F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因 traJ產(chǎn)物 (轉(zhuǎn)移因子 )的幫助下，經(jīng)接合作用過程誘動轉(zhuǎn)移到受體菌細(xì)胞內(nèi) 。 F traJ產(chǎn)物 (轉(zhuǎn)移因子 ) 松弛蛋白 （誘動基因 mob編碼） bom（與 F質(zhì)粒的 oriT類似） 一 轉(zhuǎn)座因子類別 第二節(jié) 轉(zhuǎn)座因子 ① 除了與轉(zhuǎn)座行為有關(guān)的基因以外不帶 有任何其他基因的最簡單的轉(zhuǎn)座因子，即插入序列 (insemon sequence， IS)， ②除了與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因以外還帶有其他基因的轉(zhuǎn)座因子，即轉(zhuǎn)座子 (transposOn， Tn)， ③某些具有轉(zhuǎn)座功能的溫和噬菌體如大腸桿菌的 Mu噬菌體。 1 插入序列 (IS) ? 插入序列 :是一段 ，含與轉(zhuǎn)座相關(guān)的基因，存在于染色體、質(zhì)粒或噬菌體上 ,多拷貝。 2 復(fù)合轉(zhuǎn)座元 （ posite transposon） ?復(fù)合轉(zhuǎn)座元：除含有與自身轉(zhuǎn)座相關(guān)基因 ,還含有其他基因。 IS IS Resistance Gene(s) IS IS Resistance Gene(s) 1）結(jié)構(gòu) :線形 DNA分子， IR 序列 ，游離 MuDNA兩端各接一段寄主 DNA , 整合狀態(tài)時(shí)會消失。 2） MuDNA左端含有與 轉(zhuǎn)座 有關(guān)的 A基因和 B基因 ，分別編碼分子量為 70kb和 33 kb的兩種蛋白。 ? C基因 編碼的產(chǎn)物對 A基因和 B基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用 ? 右端含有 G片段。 3 Mu噬菌體 二 轉(zhuǎn)座子按轉(zhuǎn)座行為可以分為下列幾類 1 保守型轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座過程中將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移到別的位置以后，原來位置上的轉(zhuǎn)座子便不再存在 ，所以它也稱為非復(fù)制型轉(zhuǎn)座子。 2 復(fù)制型轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)移到另一位置后原來位置上的轉(zhuǎn)座子并不消失，所以實(shí)際上在這一過程中是由原來位置上的轉(zhuǎn)座子又復(fù)制了一份到另一位置上。 3 切離型轉(zhuǎn)座子：在轉(zhuǎn)座過程中首先使轉(zhuǎn)座子從原來位置上切離 ，然后切離下來的轉(zhuǎn)座子 整合到所轉(zhuǎn)移到的位置上 。 4 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：在轉(zhuǎn)座過程中首先通過反轉(zhuǎn)錄 ,形成轉(zhuǎn)座子的 RNA拷貝，然后這一 mRNA的中央部分，即內(nèi)含子(intron)剪接到另一位置上。接受轉(zhuǎn)座子的位置上或是一個(gè)雙鏈 ，或是一 個(gè)單鏈 。最后通過互補(bǔ)DNA(pleInentary DNA． cDNA) 的合成、重組、解離等過程而完成轉(zhuǎn)座過程 I 保守型和復(fù)制型 ? 共同的結(jié)構(gòu)特征是兩端的反向重復(fù)序。由于兩端的反向重復(fù)序列的存在，一個(gè)帶有某一轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒 經(jīng)熱變性并復(fù)性后，在電子顯微鏡下可以看到一個(gè)莖一環(huán)結(jié)構(gòu) 三 轉(zhuǎn)座子的一般結(jié)構(gòu) 四 轉(zhuǎn)座機(jī)制 ? 各類轉(zhuǎn)座子有各自的獨(dú)特的轉(zhuǎn)座機(jī)制。以復(fù)制型轉(zhuǎn)座子 Tn3為例，說明轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制。 Tn3具有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，它位于兩個(gè) IR序列的中間。 tnpR ampr tnpA res （一） Tn3結(jié)構(gòu) ? Tn3全長 4957bp，兩端各有 38bpIR。 ? Tn3有 三個(gè)結(jié)構(gòu)基因 ： tnpA基因、 tnpR基因和 ampr ? tnpA基因： 編碼轉(zhuǎn)座酶（ 識別和切割給體轉(zhuǎn)座元兩側(cè)和受體靶序列兩側(cè)各一單鏈） tnpR ampr tnpA res 內(nèi)酰胺酶 ? tnpR基因 ：編碼的蛋白質(zhì)具有 拆分酶活性 （共和體拆分） ? tnpA和 tnpR基因轉(zhuǎn)錄方向相反。 ? res位點(diǎn)處于 tnpA和 tnpR基因調(diào)控區(qū)內(nèi)。包括三個(gè)結(jié)合位點(diǎn) ? tnpR蛋白質(zhì)通過與 res位點(diǎn)結(jié)合而行使拆分酶功能的。 tnpR ampr tnpA res 內(nèi)酰胺酶 （二）測驗(yàn)過程 1 首先取得 Tn3轉(zhuǎn)移到 ColEl的衍生質(zhì)粒 pMB8上后所形成的質(zhì)粒 RSFl050。 RSFl050經(jīng)離體誘變處理后得到了一系列缺失突變型。 根據(jù)它們的表型可以分為三類： 1） 氨芐青霉素抗性消失而轉(zhuǎn)座功能不變( Ap)；是氨芐青霉素抗性基因部分缺失的結(jié)果， 2） 抗性不變而轉(zhuǎn)座功能喪失； 3） 抗性不變而轉(zhuǎn)座功能增強(qiáng) 1 0～ 50倍。 ? 后兩類的功能通過下列互補(bǔ)測驗(yàn)鑒定。 2 互補(bǔ)測驗(yàn) ? 把兩個(gè)缺失突變型質(zhì)粒引入到同一帶有具有帶動轉(zhuǎn)移功能的 FKmR的 recA大腸桿菌中 (由于重組基因突變 recA的存在，可以判斷下述 ApRKmR細(xì)菌的出現(xiàn)是由于轉(zhuǎn)座而并非由于重組 )。 ? 然后，用一個(gè)對氨芐青霉素和卡那霉素都呈敏感狀態(tài)的菌株作為受體， 與這一 recA菌株在含有兩種抗生素并能排斥 recA細(xì)菌生長的培養(yǎng)基上進(jìn)行混合培養(yǎng)，選取抗卡那霉素的菌落， 測定其中的ApRKmR菌落數(shù) （轉(zhuǎn)座功能和 ApR要互補(bǔ)）。 ? △ Ap與△ 9 △ 25 △ 276都不能互補(bǔ)。它們的缺失都包括一端的反向重復(fù)序 (IR) 。 ? △ Ap與△ 52 △ 23 △ 24 △ 51 △ 90都能互補(bǔ)， 3 區(qū)域內(nèi)部的突變型的互補(bǔ) ? 為了進(jìn)行這一小區(qū)域中的互補(bǔ)測驗(yàn)， 用的不是缺失而是點(diǎn)突變。每一個(gè)點(diǎn)突變都由一個(gè) 8一核苷酸片段的插入所造成。點(diǎn)突變可以通過互補(bǔ)測驗(yàn)分為三個(gè)區(qū)域： ? 每一個(gè)區(qū)域內(nèi)的突變型都不能互補(bǔ)，不同區(qū)域間的突變型都能互補(bǔ)。 ? 使轉(zhuǎn)座功能下降的突變型都屬于轉(zhuǎn)座酶 (transposase， TnpA)基因。上面所講的使轉(zhuǎn)座功能提高 (o50倍 )的突變型屬于調(diào)控區(qū)。 五 Tn3轉(zhuǎn)座模型 ? 質(zhì)粒 pBR322上有兩個(gè)抗藥性基因：氨芐青霉素抗性基因 和四環(huán)素抗性基因， ? 在 ampr附近有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) (ori)。