【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 變異指植物組織和體細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的變異 。Larkin等（ 1981）在其綜述文章中開(kāi)始使用“體細(xì)胞克隆變異”（ somaclonal variation）這一概念。 為了區(qū)分來(lái)源于體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞的變異， Evans將 來(lái)自配子體組織的變異稱(chēng)為“配子體克隆變異”（ gametoclonal variation），以與體細(xì)胞克隆變異區(qū)分開(kāi)。 對(duì)于遺傳變異的分析而言， Orton為了統(tǒng)一術(shù)語(yǔ)，引進(jìn)了 R0、 R R2等，分別表示再生 當(dāng)代、自交第一代、第二代等，至今這一概念還在廣泛應(yīng)用。 體細(xì)胞克隆變異的遺傳基礎(chǔ) （ 1）染色體數(shù)目變異 最多見(jiàn)的是多倍體，主要是培養(yǎng)基中使用了細(xì)胞分裂素。 變異的大小與培養(yǎng)狀態(tài)、年齡、原始材料的倍性及培養(yǎng)時(shí)期有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：二倍體變異的頻率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，四倍體變異的頻率卻隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。 （ 2）染色體結(jié)構(gòu)變異 染色體結(jié)構(gòu)變異似乎是體細(xì)胞克隆變異的主要來(lái)源，最重要的是染色體缺失、倒位、重復(fù)和異位。很多體細(xì)胞再生株減數(shù)分裂時(shí)形成多價(jià)體、染色體橋、小片段、環(huán)等，充分說(shuō)明了染色體結(jié)構(gòu)變異的存在。 （ 3）點(diǎn)突變 這類(lèi)突變可分為多種類(lèi)型，一種類(lèi)型是 自發(fā)突變 ，最早證實(shí)點(diǎn)突變存在的是從煙草中利用體外篩選獲得抗chlorsulfuron的突變體。很多通過(guò)細(xì)胞篩選獲得的抗病、抗除草劑等突變體屬于此類(lèi)。 另一種點(diǎn)突變是誘發(fā)突變，培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑或進(jìn)行誘變處理。由于培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)物一直處于誘變的環(huán)境條件下，所以突變究竟是 自發(fā) 還是 誘發(fā) 很難搞清楚。 第三種點(diǎn)突變是 基因的表達(dá)及基因放大或衰減。 高等植物的某些基因在發(fā)育過(guò)程中受到某一環(huán)境刺激，可以 放大自己，即基因的拷貝數(shù)大量增加 ，這意味著該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA及蛋白質(zhì)增加。最初在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，后來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)也存在。 比如，對(duì)某一物質(zhì)的抗性，可以通過(guò)逐步增加濃度的辦法而使細(xì)胞對(duì)該物質(zhì)的抗性提高很多倍，這就是基因放大系統(tǒng)存在的很好例證。同樣，也發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞 DNA的丟失（衰減）， 如大豆懸浮系經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，其核糖體基因丟失了 1/3。 第四種點(diǎn)突變是有絲分裂交換。這種交換盡管很微弱地改變了基因的順序，但仍影響基因的表達(dá)。這種變化包括：某一基因拷貝的丟失，某一基因拷貝的重復(fù)或修復(fù)過(guò)程中基因的轉(zhuǎn)變。 轉(zhuǎn)座因子也是造成體細(xì)胞突變的原因之一，轉(zhuǎn)座子通過(guò)插入與解離使某些基因的表達(dá)受到調(diào)控。 最后細(xì)胞質(zhì)基因葉綠體和線粒體基因也能發(fā)生突變。 Gengenbach et al（ 1975）利用玉米 T小種毒素篩選獲得了抗 T小種的細(xì)胞系，這個(gè)基因已知位于胞質(zhì)中。 離體培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生各種類(lèi)型的突變體，除抗性突變體外，還有形態(tài)性狀突變體、不育性、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改變等。形態(tài)變異如矮化性、葉型等，利用這些變異可以進(jìn)行高光效育種。 培養(yǎng)再生植株中出現(xiàn)不育性的頻率較高，但大多為核基因的突變，可以用來(lái)培育不育系。產(chǎn)量和品質(zhì)的突變必須在田間通過(guò)適當(dāng)?shù)姆治霾拍艽_定。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)細(xì)胞水平的突變體篩選多數(shù)在抗性突變體方面開(kāi)展工作，如抗病、耐鹽、抗重金屬等。 突變體的篩選 為了增加突變頻率，需要進(jìn)行誘變處理。將外植體、愈傷或懸浮系用誘變劑處理，如使用化學(xué)誘變劑，要充分洗滌后再進(jìn)入下一步的工作。使用多大劑量和處理多長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到較好誘變效果，應(yīng)根據(jù)具體試驗(yàn)確定。 在突變體篩選中常采用兩種選擇法，即一步篩選法和多步篩選法。 一步篩選法是 將培養(yǎng)物接種在含有最低全部致死劑量的培養(yǎng)基上 ，表現(xiàn)出生長(zhǎng)的培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到含有抑制劑的新鮮培養(yǎng)基上。 可以看出，這種方法是一次就把篩選壓設(shè)定很高 ，使不抗細(xì)胞（野生細(xì)胞）完全不可能生長(zhǎng)，篩選出的能生長(zhǎng)的細(xì)胞即為耐（抗）性細(xì)胞系。 但在有些情況下這種方法不一定實(shí)用，有的細(xì)胞在超過(guò)最低全部致死濃度時(shí)，細(xì)胞均死亡，或單個(gè)細(xì)胞不能生存。多步篩選法是首先使用半致死劑量對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，每次繼代將上代能生長(zhǎng)的細(xì)胞系繼代到篩選劑濃度提高的新鮮培養(yǎng)基上。 在這種篩選體制下，抗性細(xì)胞應(yīng)該比野生細(xì)胞長(zhǎng)的快，通過(guò)逐步增加篩選劑水平，最終會(huì)篩選出在抑制劑超過(guò)最低全部致死濃度時(shí)也能旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞系。 但是，去除抑制劑后，抗性培養(yǎng)物的穩(wěn)定性是常出現(xiàn)的一個(gè)問(wèn)題，抗性丟失來(lái)自很多原因，包括細(xì)胞對(duì)抑制劑的生理適應(yīng)?？梢?jiàn)，多步篩選易獲得在某一抑制劑水平下，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞系。 篩選的材料對(duì)象可以是原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉 /小孢子培養(yǎng)物。利用原生質(zhì)體進(jìn)行抗性篩選有一大優(yōu)點(diǎn)：篩選出的克隆極有可能來(lái)自單細(xì)胞，但是操作困難。 利用愈傷塊篩選是最簡(jiǎn)單的方法，但這種篩選存在一定缺陷，愈傷塊里的各個(gè)細(xì)胞不能均等地接觸抑制劑，下部愈傷細(xì)胞比上部細(xì)胞吸收到較多的抑制劑，這樣就使篩選結(jié)果在一定程度上失去可靠性。 懸浮細(xì)胞篩選也很常用，細(xì)胞接觸選擇劑較均勻，但存在一定的操作復(fù)雜性?；ǚ?小孢子培養(yǎng)物用于突變體篩選有一定優(yōu)勢(shì)，突變體很容易表現(xiàn)出來(lái)，也很易純合。 在作物改良上的應(yīng)用 利用上述方法便可篩選體細(xì)胞克隆變異，將這一技術(shù)應(yīng)用于作物改良技術(shù)路線見(jiàn)圖。 優(yōu)良品種 ↓ 細(xì)胞培養(yǎng) R0 ↓ R1群體 ↓ 改良的體細(xì)胞克隆 確定遺傳方式 ↓ 田間實(shí)驗(yàn) 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 ↓ 多點(diǎn)田間實(shí)驗(yàn) 育成新品系 ↓ 繼續(xù)田間實(shí)驗(yàn)，種子富集 區(qū)域試驗(yàn) ↓ 審 定 ↓ 投入生產(chǎn) 圖 利用體細(xì)胞克隆變異育種的技術(shù)路線 （二） 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)在遺傳和育種中的應(yīng)用價(jià)值 花藥培養(yǎng)（ anther culture）是指在獲得單倍體的一種技術(shù)，之后，花粉和小孢子培養(yǎng)逐漸獲得成功，從而使單倍體細(xì)胞培養(yǎng)體系更加完善。單倍體在遺傳和育種研究中有如下優(yōu)點(diǎn)： （ 1）后代的快速純合 通過(guò)單倍體迅速產(chǎn)生純系。在異花授粉作物中，可用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（ DH系），從中篩選純合自交系用于雜交制種。由于加速純合，從而就縮短了育種周期（圖）。 母本 父本 ↓ F1→ 花藥培養(yǎng) ↓ ↓ F2 花粉植株 ↓ ↓ ↓ 加倍 ↓ ↓ 品系比較試驗(yàn) ← 選擇鑒定 ↓ 區(qū)域試驗(yàn) 圖 雜交育種與單倍體育種的周期比較 （ 2）提高選擇效率 如果某一性狀受一對(duì)基因控制，在 AA aa F2中，純合AA個(gè)體只有 1/4。如 F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中 AA個(gè)體占 1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍。 （ 3）排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾 對(duì)于雜交育種來(lái)講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會(huì)有不同程度的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)，對(duì)個(gè)體的選擇會(huì)造成一定誤差。采用 DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異。 （ 4）遺傳研究的良好材料體系 單倍體是基因互作檢測(cè)、遺傳變異估 計(jì)、連鎖群構(gòu)建、 QTL估計(jì)及定位等數(shù)量遺傳學(xué)的良好材料。尤其是近代分子生物學(xué)的發(fā)展， DH系成為分子標(biāo)記作圖的良好群體，它在一定程度上成為一種永久 BC或 F2群體。 （ 5） 突變體的篩選 由于單倍體的各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來(lái)，從而大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率，利用這一體系獲得各種突變體的事例已很多，這里就不一一贅述。 離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育 小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體小孢子，然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)生殖核），最后到達(dá)三核期而成為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)條件下，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制。 影響花藥培養(yǎng)的因素 （ 1）供體植株的生長(zhǎng)條件 供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)培養(yǎng)效果有重要影響，有時(shí)只有在控溫、一定光周期和光強(qiáng)的條件下，其花藥才能有反應(yīng)。環(huán)境條件對(duì)于不同的植物種有很大不同，所以沒(méi)有一個(gè)固定的環(huán)境控制模式。 （ 2 ） 供體植株的年齡 供體植株對(duì)培養(yǎng)效果也有一定影響，一般講，開(kāi)花初期植株的花蕾易于培養(yǎng)。 （ 3）花粉發(fā)育時(shí)期 用于培養(yǎng)的花蕾，其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)培養(yǎng)效果有較大影響，但因物種而異。在煙草中，處于第一次有絲分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。 （ 4） 花蕾和花藥的預(yù)處理 對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前對(duì)花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。如大麥花藥， 4℃ 處理 28d，或 7℃ 處理 14d，能收到最好效果?？蓪?duì)整穗、小穗、甚至分離的花藥施加預(yù)處理，只要注意處理期間不要與水接觸。也有人將花藥接種后放在低溫下預(yù)處理，不同材料需不同的預(yù)處理方式，沒(méi)有一個(gè)固定模式。 （ 5）培養(yǎng)基 究竟使用固體或液體培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的要求定。多數(shù)情況下，MS、 N6及馬鈴薯提取液培養(yǎng)基在禾谷類(lèi)作物中用的較多?；ㄋ幣囵B(yǎng)時(shí)往往需要一定的滲透壓，有的要求低濃度的蔗糖（ 2%~4%），有的要求高濃度的蔗糖（ 8%~12%）。 二細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉往往需低濃度糖，而三細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時(shí)，糖的濃度可用到13%~17%。培養(yǎng)基中所添加的維生素和激素對(duì)培養(yǎng)效果可產(chǎn)生重要影響。對(duì)于某些植物種來(lái)講，添加某種植物的提取物或椰汁可以改善培養(yǎng)效果。 （ 6）培養(yǎng)條件 多數(shù)植物在 25℃ 下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫 35℃ 下處理幾天，然后進(jìn)入 25℃培養(yǎng)能收到最好效果?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。此外，接種花藥的外植體置向、培養(yǎng)密度等有時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果也有影響。 花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株，但它的培養(yǎng)難度大。 單倍體誘導(dǎo)中存在的問(wèn)題 對(duì)于多數(shù)植物來(lái)講，能形成有活力胚的花藥百分率很低，除此之外，還有很多問(wèn)題存在。 通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有生長(zhǎng)和發(fā)育跡象，或剛開(kāi)始生長(zhǎng)便導(dǎo)致胚敗育；在產(chǎn)生單倍體的同時(shí)產(chǎn)生二倍體或四倍體；培養(yǎng)中我們需要小孢子分裂，而二倍體組織不分裂，但這種情況往往難以辦到；白化苗難以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很難分離出單倍體，因?yàn)閱伪扼w細(xì)胞的生長(zhǎng)很易被生長(zhǎng)旺盛的多倍體細(xì)胞所掩蓋。 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與植物育種 單倍體是高度不育的，需要進(jìn)行加倍處理才能應(yīng)用。秋水仙素是常用的染色體加倍藥劑，可以用 1%的秋水仙素對(duì)正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理，一般 24h左右。也可在固體培養(yǎng)基中加適當(dāng)濃度的秋水仙素。 花粉植株在培養(yǎng)過(guò)程中可以自然加倍，但頻率很低。將單倍體植株的組織或器官用作外植體，重新誘導(dǎo)愈傷組織，讓培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中自然加倍也