【文章內(nèi)容簡介】 變異指植物組織和體細胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異 。Larkin等（ 1981）在其綜述文章中開始使用“體細胞克隆變異”（ somaclonal variation）這一概念。 為了區(qū)分來源于體細胞和單倍體細胞的變異， Evans將 來自配子體組織的變異稱為“配子體克隆變異”（ gametoclonal variation），以與體細胞克隆變異區(qū)分開。 對于遺傳變異的分析而言， Orton為了統(tǒng)一術(shù)語，引進了 R0、 R R2等，分別表示再生 當(dāng)代、自交第一代、第二代等，至今這一概念還在廣泛應(yīng)用。 體細胞克隆變異的遺傳基礎(chǔ) （ 1）染色體數(shù)目變異 最多見的是多倍體，主要是培養(yǎng)基中使用了細胞分裂素。 變異的大小與培養(yǎng)狀態(tài)、年齡、原始材料的倍性及培養(yǎng)時期有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：二倍體變異的頻率隨培養(yǎng)時間的延長而降低，四倍體變異的頻率卻隨培養(yǎng)時間的延長而增加。 （ 2）染色體結(jié)構(gòu)變異 染色體結(jié)構(gòu)變異似乎是體細胞克隆變異的主要來源，最重要的是染色體缺失、倒位、重復(fù)和異位。很多體細胞再生株減數(shù)分裂時形成多價體、染色體橋、小片段、環(huán)等，充分說明了染色體結(jié)構(gòu)變異的存在。 （ 3）點突變 這類突變可分為多種類型，一種類型是 自發(fā)突變 ，最早證實點突變存在的是從煙草中利用體外篩選獲得抗chlorsulfuron的突變體。很多通過細胞篩選獲得的抗病、抗除草劑等突變體屬于此類。 另一種點突變是誘發(fā)突變，培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑或進行誘變處理。由于培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物一直處于誘變的環(huán)境條件下，所以突變究竟是 自發(fā) 還是 誘發(fā) 很難搞清楚。 第三種點突變是 基因的表達及基因放大或衰減。 高等植物的某些基因在發(fā)育過程中受到某一環(huán)境刺激，可以 放大自己，即基因的拷貝數(shù)大量增加 ，這意味著該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA及蛋白質(zhì)增加。最初在動物細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，后來在植物中發(fā)現(xiàn)也存在。 比如，對某一物質(zhì)的抗性，可以通過逐步增加濃度的辦法而使細胞對該物質(zhì)的抗性提高很多倍，這就是基因放大系統(tǒng)存在的很好例證。同樣，也發(fā)現(xiàn)植物細胞 DNA的丟失（衰減）， 如大豆懸浮系經(jīng)過較長時間的培養(yǎng)，其核糖體基因丟失了 1/3。 第四種點突變是有絲分裂交換。這種交換盡管很微弱地改變了基因的順序，但仍影響基因的表達。這種變化包括：某一基因拷貝的丟失，某一基因拷貝的重復(fù)或修復(fù)過程中基因的轉(zhuǎn)變。 轉(zhuǎn)座因子也是造成體細胞突變的原因之一，轉(zhuǎn)座子通過插入與解離使某些基因的表達受到調(diào)控。 最后細胞質(zhì)基因葉綠體和線粒體基因也能發(fā)生突變。 Gengenbach et al（ 1975）利用玉米 T小種毒素篩選獲得了抗 T小種的細胞系，這個基因已知位于胞質(zhì)中。 離體培養(yǎng)細胞會產(chǎn)生各種類型的突變體，除抗性突變體外，還有形態(tài)性狀突變體、不育性、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改變等。形態(tài)變異如矮化性、葉型等，利用這些變異可以進行高光效育種。 培養(yǎng)再生植株中出現(xiàn)不育性的頻率較高，但大多為核基因的突變，可以用來培育不育系。產(chǎn)量和品質(zhì)的突變必須在田間通過適當(dāng)?shù)姆治霾拍艽_定。實驗室內(nèi)細胞水平的突變體篩選多數(shù)在抗性突變體方面開展工作，如抗病、耐鹽、抗重金屬等。 突變體的篩選 為了增加突變頻率，需要進行誘變處理。將外植體、愈傷或懸浮系用誘變劑處理，如使用化學(xué)誘變劑，要充分洗滌后再進入下一步的工作。使用多大劑量和處理多長時間才能達到較好誘變效果，應(yīng)根據(jù)具體試驗確定。 在突變體篩選中常采用兩種選擇法，即一步篩選法和多步篩選法。 一步篩選法是 將培養(yǎng)物接種在含有最低全部致死劑量的培養(yǎng)基上 ，表現(xiàn)出生長的培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到含有抑制劑的新鮮培養(yǎng)基上。 可以看出，這種方法是一次就把篩選壓設(shè)定很高 ，使不抗細胞（野生細胞）完全不可能生長，篩選出的能生長的細胞即為耐（抗）性細胞系。 但在有些情況下這種方法不一定實用，有的細胞在超過最低全部致死濃度時，細胞均死亡，或單個細胞不能生存。多步篩選法是首先使用半致死劑量對細胞進行篩選，每次繼代將上代能生長的細胞系繼代到篩選劑濃度提高的新鮮培養(yǎng)基上。 在這種篩選體制下，抗性細胞應(yīng)該比野生細胞長的快，通過逐步增加篩選劑水平，最終會篩選出在抑制劑超過最低全部致死濃度時也能旺盛生長的細胞系。 但是，去除抑制劑后，抗性培養(yǎng)物的穩(wěn)定性是常出現(xiàn)的一個問題，抗性丟失來自很多原因，包括細胞對抑制劑的生理適應(yīng)?？梢姡嗖胶Y選易獲得在某一抑制劑水平下，細胞穩(wěn)定生長的細胞系。 篩選的材料對象可以是原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉 /小孢子培養(yǎng)物。利用原生質(zhì)體進行抗性篩選有一大優(yōu)點：篩選出的克隆極有可能來自單細胞，但是操作困難。 利用愈傷塊篩選是最簡單的方法，但這種篩選存在一定缺陷，愈傷塊里的各個細胞不能均等地接觸抑制劑，下部愈傷細胞比上部細胞吸收到較多的抑制劑，這樣就使篩選結(jié)果在一定程度上失去可靠性。 懸浮細胞篩選也很常用，細胞接觸選擇劑較均勻，但存在一定的操作復(fù)雜性。花粉/小孢子培養(yǎng)物用于突變體篩選有一定優(yōu)勢，突變體很容易表現(xiàn)出來，也很易純合。 在作物改良上的應(yīng)用 利用上述方法便可篩選體細胞克隆變異，將這一技術(shù)應(yīng)用于作物改良技術(shù)路線見圖。 優(yōu)良品種 ↓ 細胞培養(yǎng) R0 ↓ R1群體 ↓ 改良的體細胞克隆 確定遺傳方式 ↓ 田間實驗 遺傳穩(wěn)定性測試 ↓ 多點田間實驗 育成新品系 ↓ 繼續(xù)田間實驗，種子富集 區(qū)域試驗 ↓ 審 定 ↓ 投入生產(chǎn) 圖 利用體細胞克隆變異育種的技術(shù)路線 （二） 單倍體細胞培養(yǎng)及育種利用 單倍體細胞培養(yǎng)在遺傳和育種中的應(yīng)用價值 花藥培養(yǎng)（ anther culture）是指在獲得單倍體的一種技術(shù)，之后，花粉和小孢子培養(yǎng)逐漸獲得成功，從而使單倍體細胞培養(yǎng)體系更加完善。單倍體在遺傳和育種研究中有如下優(yōu)點： （ 1）后代的快速純合 通過單倍體迅速產(chǎn)生純系。在異花授粉作物中，可用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（ DH系），從中篩選純合自交系用于雜交制種。由于加速純合，從而就縮短了育種周期（圖）。 母本 父本 ↓ F1→ 花藥培養(yǎng) ↓ ↓ F2 花粉植株 ↓ ↓ ↓ 加倍 ↓ ↓ 品系比較試驗 ← 選擇鑒定 ↓ 區(qū)域試驗 圖 雜交育種與單倍體育種的周期比較 （ 2）提高選擇效率 如果某一性狀受一對基因控制，在 AA aa F2中，純合AA個體只有 1/4。如 F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中 AA個體占 1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍。 （ 3）排除雜種優(yōu)勢對后代選擇的干擾 對于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點尚處于雜合狀態(tài)，會有不同程度的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)，對個體的選擇會造成一定誤差。采用 DH群體進行選擇育種，由于各基因位點在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實變異。 （ 4）遺傳研究的良好材料體系 單倍體是基因互作檢測、遺傳變異估 計、連鎖群構(gòu)建、 QTL估計及定位等數(shù)量遺傳學(xué)的良好材料。尤其是近代分子生物學(xué)的發(fā)展， DH系成為分子標(biāo)記作圖的良好群體，它在一定程度上成為一種永久 BC或 F2群體。 （ 5） 突變體的篩選 由于單倍體的各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，從而大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率，利用這一體系獲得各種突變體的事例已很多，這里就不一一贅述。 離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育 小孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體小孢子，然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個營養(yǎng)核和一個生殖核），最后到達三核期而成為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)條件下，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制。 影響花藥培養(yǎng)的因素 （ 1）供體植株的生長條件 供體植株的生長條件對培養(yǎng)效果有重要影響，有時只有在控溫、一定光周期和光強的條件下，其花藥才能有反應(yīng)。環(huán)境條件對于不同的植物種有很大不同，所以沒有一個固定的環(huán)境控制模式。 （ 2 ） 供體植株的年齡 供體植株對培養(yǎng)效果也有一定影響，一般講，開花初期植株的花蕾易于培養(yǎng)。 （ 3）花粉發(fā)育時期 用于培養(yǎng)的花蕾，其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育時期對培養(yǎng)效果有較大影響，但因物種而異。在煙草中，處于第一次有絲分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。 （ 4） 花蕾和花藥的預(yù)處理 對于有些物種，培養(yǎng)前對花藥和花蕾進行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。如大麥花藥， 4℃ 處理 28d，或 7℃ 處理 14d，能收到最好效果。可對整穗、小穗、甚至分離的花藥施加預(yù)處理，只要注意處理期間不要與水接觸。也有人將花藥接種后放在低溫下預(yù)處理，不同材料需不同的預(yù)處理方式，沒有一個固定模式。 （ 5）培養(yǎng)基 究竟使用固體或液體培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的要求定。多數(shù)情況下，MS、 N6及馬鈴薯提取液培養(yǎng)基在禾谷類作物中用的較多?；ㄋ幣囵B(yǎng)時往往需要一定的滲透壓，有的要求低濃度的蔗糖（ 2%~4%），有的要求高濃度的蔗糖（ 8%~12%）。 二細胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉往往需低濃度糖，而三細胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時，糖的濃度可用到13%~17%。培養(yǎng)基中所添加的維生素和激素對培養(yǎng)效果可產(chǎn)生重要影響。對于某些植物種來講，添加某種植物的提取物或椰汁可以改善培養(yǎng)效果。 （ 6）培養(yǎng)條件 多數(shù)植物在 25℃ 下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫 35℃ 下處理幾天，然后進入 25℃培養(yǎng)能收到最好效果?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般在暗處進行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。此外，接種花藥的外植體置向、培養(yǎng)密度等有時對培養(yǎng)效果也有影響。 花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。其優(yōu)點在于花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含藥壁、花絲、藥隔等體細胞組織的干擾而形成的體細胞植株，但它的培養(yǎng)難度大。 單倍體誘導(dǎo)中存在的問題 對于多數(shù)植物來講，能形成有活力胚的花藥百分率很低，除此之外，還有很多問題存在。 通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時沒有生長和發(fā)育跡象，或剛開始生長便導(dǎo)致胚敗育；在產(chǎn)生單倍體的同時產(chǎn)生二倍體或四倍體；培養(yǎng)中我們需要小孢子分裂，而二倍體組織不分裂，但這種情況往往難以辦到；白化苗難以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很難分離出單倍體，因為單倍體細胞的生長很易被生長旺盛的多倍體細胞所掩蓋。 單倍體細胞培養(yǎng)與植物育種 單倍體是高度不育的，需要進行加倍處理才能應(yīng)用。秋水仙素是常用的染色體加倍藥劑，可以用 1%的秋水仙素對正處于對數(shù)生長期的懸浮細胞進行處理，一般 24h左右。也可在固體培養(yǎng)基中加適當(dāng)濃度的秋水仙素。 花粉植株在培養(yǎng)過程中可以自然加倍，但頻率很低。將單倍體植株的組織或器官用作外植體，重新誘導(dǎo)愈傷組織，讓培養(yǎng)細胞在培養(yǎng)過程中自然加倍也