【文章內容簡介】 ough other mechanisms: Histone methylation occurs at loci homologous to the siRNA target histone methyltransferase RNAdependent RNA polymerase Matzke, M. and Matzke, A. J. M. Science 301, 10601061 (2022) Schramke, V. and Allshire, R. Science 301, 10691074 (2022) Questions about RNAi ?What is the endogenous biological function of the RNAi machinery? (The RNAi machinery may provides a mechanism for responding nucleic acid invaders. It could stabilize the genome by sequestering repetitive sequences, such as transposons, in heterochromatin making them unavailable for rebination events that would lead to chromosomal translocations) ?Is RNAi under negative regulation? Dicer ? Dicer important ponent of RNAi Dicer ? Dicer最初是在果蠅中發(fā)現的，其同源基因在真菌，線蟲，以及植物中均存在。 ? Dicer編碼的蛋白屬于 RNaselII家族成員，具有保守的解旋酶 DexH／ DEAH結構域 (domain)、RNase III基序 (motif)、 dsRNA結合結構域以及PAZ結構域 。 ? 氨基端的 DexH／ DEAH解旋酶結構域屬于解旋酶超家族成員 II，其功能可能是催化 dsRNA解螺旋，利于 Dicer切割； RNase III基元可能參與切割dsRNA； PAZ結構域與 RNA結合有關． Dicer ? 在 ATP存在時， Dicer不僅可以將 dsRNA切割成siRNA ，而且也可以切割 miRNA前體產生miRNA(microRNA) 。 ? 對于 miRNA的形成過程， Lee等曾提出了一個兩步加工模型。首先在細胞核中長的 RNA(primiRNA)被切割，產生約 70 nt的 pre—miRNA，pre—miRNA輸出到細胞質中，并被進一步加工成成熟 miRNA． ? Lee等在人細胞中發(fā)現了另一個 RNaseIII家族成員Drosha，并證明 Drosha將 miRNA切割成 pre—miRNA，后者經 Dicer加工成成熟 miRNA．同時他們證明 Drosha的同源基因在線蟲，果蠅，鼠等生物中也是保守的。 Dicer ? Lund等發(fā)現了負責將 pre—miRNA從細胞核運往胞質的關鍵因子 Exportin一 5(Exp5)，這些結果表明 Lee等的 miRNA兩步加工模型在生物體內是存在的。 Dicer ? 每個 Dicer蛋白具有 5個功能域．為了達到使雙鏈RNA分子降解的目的，必需兩個 Dicer蛋白共同起作用，形成二聚體． Dicer二聚體形成以后，就產生了四個復合的活性中心．與雙鏈 RNA起作用時，四個活性中心的二個將要失活，從而使得降解過程是每隔一定的間隔進行的．對于第一類細菌RNA酶，這個間隔為 9—11個核苷酸，而對于Dicer家族，這個間隔正好為 22個核苷酸，即每隔22個核苷酸， Dicer蛋白將雙鏈 RNA降解一次．然而， Dicer結構的微小改變均會引起這種催化中心的間隔的改變，所以不同物種產生 siRNA的長度也會略有差異． Dicer Doublestranded RNA triggers processed into siRNAs by enzyme RNAseIII family, specifically the Dicer family Processive enzyme no larger intermediates. Dicer family proteins are ATPdependent nucleases. These proteins contain an aminoterminal helicase domain, dual RNAseIII domains in the carboxy terminal segment, and dsRNAbinding motifs. Contd….. They can also contain a PAZ domain, which is thought to be important for proteinprotein interaction. Dicer homologs exist in many anisms including C. elegans, Drosphila, yeast and humans Loss of dicer: loss of silencing, processing in vitro Developmental consequence in Drosophila and C. elegans Gene Silencing Pathways in Plants AG0 AG0 AG01 AG04 24nt 21nt 22nt 21nt siRNA miRNA tasiRNA Heterochromatin formation dsRNA templates DCL3 RDR6 DCL4 DCL2 DCL1 mRNA cleavage Virus RNA cleavage mRNA cleavage Developmental regulation Viral defence Control of developmental timing Evolutionary tree of dicer genes in plants Large scale gene duplication Time in million years (My) dcl1 dcl2a dcl2b dcl3a dcl3b dcl4 Nonplant dicer Maize Wheat Barley Poplar Arabidopsis Fungi Mammals Green Algae 90 60 55 200 955 1625 1550 10 Rice Insects Monocots Dicots 975 25 165 270 15 10 5 70 1967 Ciliates + + + + Giardia 2,300 RISC(RNA—induced silencing plex) ， RNA誘導沉默復合體 ? 果蠅的 RISC是由小分子 RNA(siRNA或miRNA)和蛋白質組成的具有核酸酶活性的復合物，它可以識別并切割同源靶 mRNA 。 ? SiRNA是最早被確認的 RISC組分．它是一種長 20 nt左右的雙鏈 RNA， 3’末端帶有 2個突出的堿基， 5’末端為磷酸基團 。 ? 在 RNAi中，它作為向導 RNA(guide RNA)，通過堿基配對識別靶 RNA 。 RISC ? 果蠅 RISC，證明 Ago一 2(Argonaute一 2)是RISC的核心組分 (Hammond et a1．， 2022)之一． Ago一 2屬于 Argonaute蛋白家族． Argonaute家族的蛋白質具有典型的PAZ結構域和 Piwi結構域． ? Piwi結構域是該家族蛋白特有的與 RNAH源，其功能可為ＲＮＡ ase． RISC ? RNA induce silence Complex RISC ? PAZ結構域在 Dicer蛋白質中也存在，核磁共振以及生化研究結果表明 PAZ結構域具有結合 ssRNA活性 。 ? Argonaute家族蛋白的編碼基因在大部分真核生物中是保守的．基因組序列分析解釋出線蟲基因組有 24個、擬南芥有 7個、果蠅和人各有 4個 Argonaute基因．除了 Ago2之外， AGO家族的其他成員也參與 RNAi，如線蟲的 RDE一 1，脈孢菌的QDE一 2，擬南芥的 AG01．這些基因的突變均會導致 RNAi缺陷。 RISC（其他功能） ? 除了參與 RNAi之外， AGO家族成員還有其他的重要生理功能，如擬南芥 agol突變體亦表現出葉子的發(fā)育異常； ? 果蠅 AGO家族的 Sting與雌雄性細胞的增殖(proliferation)有關， Piwi與雄性育性有關，agol參與神經系統(tǒng)的形成； ? dFXR和 VIG是果蠅 RISC的另外兩個組分，它們可能作為 RNA結合蛋白參與 RNAi，確切的功能目前還不清楚。 RISC ? TudorSN是果蠅 RISC的另一個組分，它具有核酸酶活性，可能負責 RNA的降解。 ? TudorSN的基因在線蟲，果蠅，擬南芥，裂殖酵母以及哺乳動物中是保守的。 RISC(推測的） ? 令人不解的是：在離體實驗中， TudorSN既可以切割 RNA也可以切割 DNA，而至今尚未發(fā)現 RISC有切割 DNA的能力．另外，TudorSN對底物 RNA的切割沒有序列特異性 ? 線蟲 MUT7突變體表現為 RNAi缺陷，MUT7基因編碼 RNase D類蛋白，后者具有核酸外切酶活性，因此推測它可能是 RISC的組分之一． RdRP ? RNA dependent RNA polymerase RNA依賴性的 RNA聚合酶 (RNA dependent RNA Polymerase。 RdRP) ? 所有 RNA病毒均編碼 RdRP . ? RdRP參與基因組的復制， mRNA的合成以及其他的一些重要的生物學過程 . ? 許多真核生物基因組都有 RdRP的編碼基因。真核生物中的 R