elisa知識簡介ppt課件(編輯修改稿)
2024-11-15 04:45 本頁面
【文章內容簡介】 后的步驟中干擾物質的再吸附。 常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠。脫脂奶粉 ,比較價廉，可以高濃度使用（ 5%）。 所有的 ELISA固相均需封閉？ 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫 20磷酸鹽緩沖液。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 ELISA的試劑準備 B 結合物 即酶標記的抗體（或抗原）是 ELISA中關鍵的試劑 1 酶的催化活性 2抗體（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 結合物用的抗原和抗體 制備結合物時所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在 ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 酶 純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。 酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。 在 ELISA中， HRP， AP，葡萄糖氧化酶， β D半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 結合物的制備 酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。 （ 1） 戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。有效（結合率達 60%70%）和重復性好。 交聯反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。 （ 2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將 HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成 chiff氏堿而結合。簡便有效 . 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 結合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。 制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 結合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（ HRP結合物加硫柳泵， AP結合物可加疊氮鈉）。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 結合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上： %牛血清白蛋白， %吐溫 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達 6個月。 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 試劑準備 C 酶的底物 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 酶的底物 HRP的底物 OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在 492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。 DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯苯胺 (TMB)和 ABTS 。 E 原理 類型 試劑準備 對照 標本 結果 TMB經 HRP作用后共產物顯藍色。 TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與 H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后， TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。 ABTS雖不如 OPD
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