【文章內(nèi)容簡介】 處理后的 PCR產(chǎn)物和載體能形成一個可被轉(zhuǎn)入一個不需結(jié)扎的大腸桿菌之中的穩(wěn)定環(huán)狀雜交產(chǎn)物。 隨著技術(shù)的發(fā)展，第二種酶被引入 PCR產(chǎn)物的處理中 —— T4核酸內(nèi)切酶 V，可以在 3’端破壞 DNA磷酸二酯骨架制造一個脫堿基位點。 因此， UDG和 T4內(nèi)切核酸酶 V連續(xù)作用在PCR產(chǎn)物中， 與 一個 3’端 含有單 U殘基的引物 一起 ，可以有效地 被 用于克隆 。商用公司通過一種簡單的雙酶處理法將兩種酶混合到一起， 稱為 USERTM enzyme mix， 并作出一定程度上的優(yōu)化改進。 這種 USER fusion技術(shù)被認為是一種高效率且通用性強的技術(shù)。 [8] 2實驗材料與方法 SUR1啟動子的克隆 啟動子是一段位于 結(jié)構(gòu)基因 539。端上游區(qū)的 DNA序列，能活化 RNA聚合酶，使之與模板 DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性 ，即 啟動子是 RNA聚合酶 特異性識別 和結(jié)合的 DNA序列 ， 啟動子是基因的一個組成部分，控制 基因表達 的起始時間和表達的程度 ， 本身不控制基因活動 ， 而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄 因子的蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動的。 一般認為目的基因上游約 2kb即包含目的基因啟動子 片段 ， 由于所需克隆的片段較長，故選擇 USER fusion方法來克隆這段目的基因片段， 這種方法通用性強，并且準確率和效率都比較高 。 多聚酶鏈反應(yīng) 擴增 包含 SUR1啟動子全長 cDNA的質(zhì)粒模板，寡核苷酸引物序列從 Invitrogen公司購買， 依照說明書使用 PfuTurbo CX Hotstart DNA聚合酶行駛反應(yīng)。 所涉及引物序列見表一 （ A、 B） 引物 序列 SUR1啟動子 FP 5′ GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT3′ SUR1啟動子 RP 5′ GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGAGTTCTT3′ 表一（ A） SUR1啟動子引物 SUR1 基因的組織定位 引物 序列 SUR1啟動子 fusion FP1 5’ ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT3’ SUR啟動子 fusion RP1 5’ ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG3’ SUR1啟動子 fusion FR2 5’ ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG3’ SUR1啟動子 fusion RP2 5’ AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG3’ 表一（ B） SUR1啟動子 USER fusion 引物 DNA純化 根據(jù)廠家說明書用 QIAquick PCR純化工具對 PCR產(chǎn)物進行柱相純化， 純化產(chǎn)物以原體系的三分之一的蒸餾水進行洗脫。 純化的 PCR產(chǎn)物與預(yù)備載體的結(jié)合 等體積的純化 PCR產(chǎn)物連同等體積的帶有 PacI/pCambia3300一起，于瓊脂糖凝膠上進行跑膠， 通過條帶亮度 分析相對濃度， 決定 混合配比 3:3:3:1 。 用 USERTM enzyme mix處理 一微升 10 TE buffer【 100mM TrisHCl, 1mMEDTA (pH )】 、 1U 的 USERTM enzyme mix(1U/μL)加到 8 μL預(yù)備載體和 PCR純化產(chǎn)物的混合物，反應(yīng)在 37℃的溫度下孵育 20分鐘，接著在 25℃的條件下反應(yīng) 20分鐘，預(yù)備載體在反應(yīng)混合物中的量大概占 pmol. 轉(zhuǎn)化 全部 10μL的反應(yīng)混合物與 50μL感受態(tài)大腸桿菌細胞進行熱激反應(yīng) 質(zhì)粒的準備與限制性分析 依照廠家說明書，使用 GenEluteTM 質(zhì)粒小量制備工具， 4ml過夜培養(yǎng)，被純化的質(zhì)粒用 50μL的水洗脫， 在一個 20μL包含 1 NEB Buffer 2[50mM NaCl, 10mM TrisHCl, 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol (pH )]和 100μL/ml BS A的反應(yīng)體系中 每兩微升質(zhì)粒 用 10U的 SpeI,37℃條件下切割 2小時 。 SUR1 基因的組織定位 在含有卡那霉素固體培養(yǎng)基中篩選， PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒 ，取陽性克隆 菌落 。 載體示意圖如圖 3 圖 3： 載體示意圖 所構(gòu)建 載體為二元載體， Basta為在植物體中的篩選標記， Kana為菌體中的篩選標記。所連接的 GUS基因用于后續(xù)組織定位之用。 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 重組表達載體導(dǎo)人農(nóng)桿菌。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓 2 500 kV／ em；電容 25 F；電阻 500 Q。電擊 3～ 5 ms后，取出電擊杯，迅速加入 800 L的 LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至 1． 5 mL的EP管中，在 28℃震蕩培養(yǎng) 3 h；取 100／ ,L菌液涂布于含 Gen(50／ ,g／ mL)和 Kan(50／ ,g／ mL)的 LB平板中 28℃培養(yǎng) 24 h，即可長出陽性克隆。 陽性克隆的菌落 PCR與酶切鑒定。隨機挑取單菌落，在裝有 1 mL的 LB和 1． 5 mL的抗生素的離心管中 28℃培養(yǎng) 12 h左右。取 5O L培養(yǎng)物，煮沸 5 rain， 5 000 r／ rain離心 2 min，取 1～ 2／ ,L上清進行 PCR擴增后電泳檢測。選取菌落 PCR驗證后的菌液抽提質(zhì)粒，并用 BstE 1I和 Bgl 1I雙酶切后，電泳檢測。 農(nóng)桿菌浸染法侵染擬南芥 SUR1 基因的組織定位 前期準備： 取 150ml 含相應(yīng)抗生素的液體 LB 培養(yǎng)基，接入 23ml 準備好的農(nóng)桿菌菌液，大搖過夜至培養(yǎng)基由紅色轉(zhuǎn)為黃色。將培養(yǎng)后的 150ul 農(nóng)桿菌菌液導(dǎo)入滅過