畢業(yè)論文—sur1基因的組織定位(文件)
【正文】 硫苷核心結(jié)構(gòu)形成的階段中 SUR1表達(dá)的 CS lyase SUR1 能 將 Salkylthiohydroximates（ S烷基硫代烷肟） 轉(zhuǎn)換成 Thiohydroximates（硫代肟基酸） [6]從而保證 下一步反應(yīng) 的進(jìn)行 (見圖 2)。 處理后的 PCR產(chǎn)物和載體能形成一個(gè)可被轉(zhuǎn)入一個(gè)不需結(jié)扎的大腸桿菌之中的穩(wěn)定環(huán)狀雜交產(chǎn)物。 這種 USER fusion技術(shù)被認(rèn)為是一種高效率且通用性強(qiáng)的技術(shù)。 多聚酶鏈反應(yīng) 擴(kuò)增 包含 SUR1啟動(dòng)子全長 cDNA的質(zhì)粒模板，寡核苷酸引物序列從 Invitrogen公司購買， 依照說明書使用 PfuTurbo CX Hotstart DNA聚合酶行駛反應(yīng)。 SUR1 基因的組織定位 在含有卡那霉素固體培養(yǎng)基中篩選， PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒 ，取陽性克隆 菌落 。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓 2 500 kV／ em；電容 25 F；電阻 500 Q。取 5O L培養(yǎng)物，煮沸 5 rain， 5 000 r／ rain離心 2 min，取 1～ 2／ ,L上清進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后電泳檢測。 用于 侵染 的 1／ 2 MS 配方：（每 150 ml 菌液加 50 ml 1／ 2 MS 液） MS 大量 5 ml 蔗糖 10 g 水 95 ml 表面活性劑 20 ul 常用 1／ 2 MS 配方（ 1 L）： 10X 大量元素 50 ml 100X 微量元素 5 ml 100X 鐵鹽 5 ml 蔗糖（ 1%） 10 g 瓊脂粉 8 g 擬南芥生長土壤： 腐殖土：蛭石 =1:1 混勻，裝雙層袋子，高壓 121℃滅菌 40 分鐘 注意：滅完菌后要加適量水將土和濕，不能太濕，然后土裝入缽里壓實(shí)，將缽放入裝有水的底盤中，一個(gè)小時(shí)左右缽中土壤浸濕后便能種苗。 后續(xù)操作 1 種植健康的擬南芥直到開花。 3準(zhǔn)備攜帶目的基因在 雙 元載體 （雙元載體有兩套篩選引子，菌體中用一種，植物中用一種） 里的農(nóng)桿菌菌株 。侵染后悉心照料，保持水分充足。 Basta篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥 收獲后的干燥 種子經(jīng)表面消毒，放于 4℃冰箱 ， 春化 4天 后 ，播種于培養(yǎng)土中，待長出 2片真葉 后 ，噴灑 1： 1 000的 Basta除草劑進(jìn)行篩選 。 M 1 2 3 圖 5： Marker為 2021bp,從上至下依次為： 202 1000、 750、 500、 250、 100 1號為空白對照， 3號為挑取的單菌落。 SUR1啟動(dòng)子農(nóng)桿菌的 PCR檢測 對上述測序過的大腸桿菌進(jìn)行提取質(zhì)粒 ，重組 表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌， 挑取陽性菌落 對其進(jìn)行菌落 PCR凝膠電泳，擴(kuò)增 SUR1啟動(dòng)子的第二段， 原理同結(jié)果。剩余有 Basta抗性即存活下去者即為被轉(zhuǎn)化成功的幼苗。 由于本研究所涉及的 SUR1啟動(dòng)子，所需克隆的基因長度達(dá) 2021bp，對這種長度的基因，傳統(tǒng)的 PCR方法難以克隆出準(zhǔn)確的目的基因，并且酶的效率也會(huì)變低。大大的節(jié)約了時(shí)間并提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行提供了優(yōu)越條件。不僅使我樹立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。 。在此，謹(jǐn)向?qū)?及師兄 表示崇高的敬意和衷心的感謝 ! 本論文的順利完成，離不開各位老師、同學(xué)和朋友的關(guān)心和幫助。 由于 時(shí)間并未 進(jìn)行到對其的 GUS染色處理， 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行討論。 從而得到了較長目的基因 —— SUR1啟動(dòng)子的克隆產(chǎn)物。 轉(zhuǎn)錄的起始 ， 是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段， 影響 基因表達(dá)的水平 ， 一般認(rèn)為目的基因上游約 2kb即包含目的基因啟動(dòng)子片段，由于所需克隆的片段較長，本研究選用 USER fusion技術(shù)來完成這段目的基因的克隆。 Basta篩選結(jié)果 用濃度為 1： 1 000的 Basta除草劑 噴灑四葉期的幼苗 進(jìn)行篩選 ，未轉(zhuǎn)化成功的幼苗由于不含抗 Basta除草劑基因而枯萎變黃被殺死；成活的即為轉(zhuǎn)化成功的幼苗。 SUR1 基因的組織定位 SUR1啟動(dòng)子第一段 SUR1啟動(dòng)子第二段 SUR1啟動(dòng)子第三段 SUR1啟動(dòng)子 圖 6：重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖 為印證連接正確并成功導(dǎo)入大腸桿菌， SUR1啟動(dòng)子的第二段出于連接的中心， 對 SUR1啟動(dòng)子第二段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增， 如未被導(dǎo)入或連接錯(cuò)誤能得不到與之前 （圖 5） 一致的結(jié)果， 所得結(jié)果 約 600bp，與之前 圖 5結(jié)果一致， 證明三段啟動(dòng)子均被轉(zhuǎn)入并連接正確。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 SUR1啟動(dòng)子 USER fusion 克隆結(jié)果 （圖 4） SUR1啟動(dòng)子分割成三段的 PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖 ， Marker均為 2021bp,從上至下依次為： 202 1000、 750、 500、 250、 100 SUR1 基因的組織定位 M SUR1啟動(dòng)子 第一段 M SUR1啟動(dòng)子 第二段 SUR1 基因的組織定位 M SUR1啟動(dòng)子第三段 圖 4： 擴(kuò)增條帶顯示， SUR1啟動(dòng)子克隆第一段約 800bp左右，第二段越 600bp左右，第三段越 600bp左右，三段合約 2021bp，所得片段與預(yù)期一致。 6 澆水松土正常養(yǎng)殖，種子成熟后停止?jié)菜? 4 搖床搖農(nóng)桿菌 ，用 5%的蔗糖溶液 （ 蔗糖溶液中加入表明活性劑， 達(dá)到 濃度 %） 混懸 到 O
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