【文章內(nèi)容簡介】 陜西科技大學畢業(yè)論文 6 2 實驗材料與方法 實驗材料 實驗菌株 Aspergillus flavus CGMCC 購于中國普通微生物菌種保藏管理中心， PDA 培養(yǎng)基 4℃ 保存。 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（ PDA 培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、 β環(huán)糊精 12 g、蒸餾水 1 L，自然 pH， 121℃ 高壓滅菌 20 min。 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（ PDB 培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、蒸餾水1L、自然 pH、 121℃ 高 壓滅菌 20 min。 試劑：乙醚：天津化學試劑廠；吐溫（化學純）購買于天津市博迪化工有限公司；四氟乙烷（分析純）購買于天津市河北區(qū)海晶精細化工廠 ；生理鹽水； 1:1 甘油水。 實驗儀器與設備 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 7 表 21所需儀器與設備 設備名稱 設備型號 生產(chǎn)廠家 1000 ml 三口燒瓶 蒸餾頭 蛇形冷凝管 尾接管 接受瓶 分液漏斗 打孔器 亞臨界工藝技術裝置 FA2021 常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司 電子天平 722N 上海精密科學儀器有限公 司 電子調(diào)溫萬用電爐 DK98Ⅱ 天津市泰斯特儀器有限公司 OPTEC 奧特光學生物顯微鏡 BK5000 重慶奧特光學儀器有限公司 顯微鏡數(shù)碼顯像系統(tǒng) S/N T3003581 西安中顯光電科技有限公司 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 PYXDHS50X65BSII 生物安全柜 BSC1300A2 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠 快速混勻器 手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQSG4628OS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE52A 上海亞榮生化儀器廠 陜西科技大學畢業(yè)論文 8 實驗方法 孜然精油的提取 （ 1）傳統(tǒng)水蒸餾法 原料處理方法：采回后經(jīng) 60℃ 烘干、粉碎 ,過 60 目篩后于一 45℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩? 精密稱取 100 g孜然粉置于 1000 ml圓底燒瓶中，加 500 ml的蒸餾水和幾粒沸石，連接好裝置，用電加熱套對圓底燒瓶進行加熱。（此處為常壓蒸餾）料液比為 1:5，溫度一般為 98℃ 左右。 共收集水蒸汽餾出液約 270ml后停止蒸餾。 用無水乙醚萃取餾出液，每次加乙醚約 90ml ，萃取三次， （ 餾出液與乙醚比例為 1:1） 將三次乙醚萃取液合并，萃取液以無水硫酸鈉干燥后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑獲 得精油。該精油用于 GC MS分析和抗菌性實驗。 （ 2） 亞臨界萃取法 [17] 原料處理方法：采回后經(jīng) 60℃ 烘干、粉碎，過 60 目篩后于 45℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩? 具體條件 :進料量： 200 g 萃取壓力： mpa 萃取溫度： 3040℃ 萃取時間： 60 min 孜然精油 GCMS 的分析 [18][19] 樣品處理：各取 300 μl由水蒸餾得到的精油和由亞臨界萃取得到的精油。 GCMS 條件 ： （ 1） 色譜條件：色譜柱 ： DB5 30 （ μm） film； （ 2） 溫度：氣化室溫度 250℃ ； （ 3） 程序升溫 ： 40℃ （ 3 min）以 10℃ /min 上升到 90℃ ， 再以 8℃ /min 上升到 250℃ （ 8min）； 進樣量 μL； 載氣 ： 氦氣 ； 流量 ： 1ml /min； 分流比 60： 1。 （ 4） 質(zhì)譜條件 : 質(zhì)量范圍 ( m/z) 為掃描范圍： 30450 amu ，電離電壓 70 eV，發(fā)射電流： 50微安 ， 接口溫度 ： 250℃ ， 離子源溫度： 200℃ ， 電離方式 ： EI? 。 菌種 活化 ① 用浸過 70％ 酒精的脫脂棉擦凈安瓿瓶 ② 用鑷子將鋁封口打開 ③ 取約 mL菌體懸浮液移植于指定的瓊脂培養(yǎng)基上，剩余的菌懸液注入指定的液體培養(yǎng)基中（ 34 mL），然后在 28℃ 下培養(yǎng) 5 d，再次接種培養(yǎng) 5 d完成第二代培養(yǎng)。 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 9 抑菌測定：生長速率法 (揮發(fā)接觸法 ) 實驗步驟： （ 1）馬鈴薯培養(yǎng)基（ PDA培養(yǎng)基）的配制 （ a） 配制 20％馬鈴薯培養(yǎng)基 取去皮馬鈴薯 200 g，切成小塊，加水 1000 mL。 80℃浸泡 1 h，用紗布過濾，然后補足失水至所需體積。 121℃ 滅菌 20分鐘，即 成 20％ 馬鈴薯浸汁。 （ b）配制時，按每 100 mL馬鈴薯浸汁加入 12 gβ環(huán)糊精， 2 g瓊脂，繼續(xù)加熱融化，并補足失水。 （ c） 高壓蒸汽滅菌 121℃ 滅菌 20 min。 （ 2 ） 孢子懸浮液的制備：用 2 ml 左右的無菌生理鹽水將黃曲霉斜面上的孢子沖洗下（采用第一代黃曲霉），倒入棕色小瓶，然后放在搖床上震蕩，使成團的孢子打散。 （ 3） 設置實驗組與對照組，實驗組一： 1， 2， 3號培養(yǎng)皿 （三個平行） 。實驗組二： 3，4， 5號培養(yǎng)皿 （三個平行）。 對照組： 6， 7， 8號培養(yǎng)皿 （三個平行） 。 （ a）將溶化的培養(yǎng)基分別倒 入平皿中各 20 mL，混勻，待凝固。 （ b） 待培養(yǎng)基 凝固后將 6 mm濾紙片放入培養(yǎng)基中央，每個培養(yǎng)基中放一個濾紙片。 (c) 吸取制備好的 黃曲霉 10 μL分別滴在濾紙片上，倒置。 （ d）倒置后，在實驗組一培養(yǎng)皿蓋上各放入一個濾紙片，在每個濾紙片上滴入 200 μl由水蒸餾蒸出的孜然精油，實驗組二每個濾紙片上各滴入 200 μl由 亞臨界萃取得到的孜然精油。 （ e）將培養(yǎng)基全部倒置放在 28℃下培養(yǎng)。實驗組需在培養(yǎng)皿外包裹幾層保鮮膜。以上操作均在無菌條件下進行。 每隔 24 h用十字交叉法測量菌 落直徑 ，并且在 365 nm紫外儀下拍照，記錄它的熒光性 。 培養(yǎng)期為 57天。 孜然精油對黃曲霉 菌絲體形態(tài)的影響 觀察黃曲霉 菌絲體形態(tài)： （ 1） 將黃曲霉 PDA培養(yǎng)基中， 分別設置對照組和實驗組一，實驗組二。待培養(yǎng)基凝固后分別在三個平板上滴各 10 μL黃曲霉 ，微晃使其分布均勻， 28℃培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng) 24 h后，采取揮發(fā)接觸法 ，在每個培養(yǎng)皿蓋上放入一個濾紙陜西科技大學畢業(yè)論文 10 片，兩個實驗組各滴入 20 μL水蒸餾得到精油及亞臨界萃取得到的精油。 （ 2） 繼 續(xù)培養(yǎng) 24 h后采用棉蘭染色法挑取少許菌絲在顯微鏡下進行觀察分析，觀察兩種不同方法提取出的孜然精油對 黃曲霉 ， 同時觀察不經(jīng)孜然精油處理的黃曲霉菌絲體形態(tài)， 記錄并分析圖像。 孜然精油對黃曲霉 孢子萌發(fā)的影響 分別將含由水蒸氣蒸餾法得到的孜然精油 10 μL，亞臨界萃取得到的孜然精油 10 μL和不含精油的培養(yǎng)基加入三個凹槽載玻片的凹槽中，每孔各 90 μL（包含精油），加精油的培養(yǎng)基中要滴入少量吐溫。再向每孔中接入 10 μL黃曲霉孢子懸浮液，蓋上蓋玻片。置于含一定量甘油水 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。 28℃ 下 培養(yǎng) 10 h，分別于 0、 10h分別 用顯微鏡分析觀察黃曲霉孢子的萌發(fā) 狀態(tài)，記錄并分析圖像。 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 11 %%100100 %100????????ggg原料重量離心管重量離心管重量）（油重量精油得率%100%200g ???????? 100%原料重量 離心管重量離心管重量）（ 油重量精油得率3 結(jié)果與討論 孜然精油提取的結(jié)果與討論 水蒸餾法精油得率計算： 亞臨界萃取法精油得率計算： 水蒸餾法是目前最常用的植物精油提取的方法之一。該方法設備簡單、容易操作，適用于在水中溶解度不大的成分的提取，可分為水蒸餾和水蒸氣蒸餾兩種方式。水蒸餾是指將植物原料與水按照一定的比例混合后，直接加熱蒸餾出精油和水，冷 卻以后，分離出植物精油。 該方法但在蒸餾過程中植物原料受熱焦化，易導致熱不穩(wěn)定成分揮發(fā)損失和分解，對有些組分有大的破壞作用，進而影響精油的質(zhì)量和試驗結(jié)果。并且在實驗中，將油水混合物分離時用乙醚萃取，萃取后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，整個過程中存在萃取不充分，溶劑除不干凈等情況，導致最后精油得率變低。 水蒸氣蒸餾法的優(yōu)點是對實驗設備要求不高、易操作、成本較低、產(chǎn)品純度高，然而提取時間較長、提取率一般較低，提取的物質(zhì)主要為萜烯類 (以單萜烯為主 )和芳香族的芳香物質(zhì)，而非揮發(fā)性成分（如色素、抗氧化成分及營養(yǎng)性成分）或高沸 點的物質(zhì)一般不會被提取出來。另外，由于原料與水蒸氣長時間接觸，部分成分容易遭到破壞，且水溶性物質(zhì)不易蒸出 [20]。 亞臨界萃取技術是近十幾年來剛剛興起的一種新型萃取技術，具有萃取時間短、效率高、能耗低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，但仍然存在著萃取率有待提高的問題，且當樣品不同時，需清洗儀器，存在儀器清洗不干凈問題，導致精油中有可能混有其他樣品，降低了精油的純度。 兩種不同方法得出的孜然精油顏色為淡黃色，有香味。亞臨界萃取的精油顏色較水蒸餾法更深，香味更濃。同時，該精油為揮發(fā)性物質(zhì)，易揮發(fā)，也減少了其精油量。需陜西科技大學畢業(yè)論文 12 用多層 保鮮膜包裹后于 4℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩? 孜然精油化學成分的分析與討論 氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術（ GCMS）有高的靈敏度，好的選擇性和分析速度快等多個優(yōu)點，對于植物精油香料的分析，氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術已成為首選。 GCMS 分析得到的總離子流譜圖，如圖所示分別為水蒸餾得到的精油和亞臨界萃取得到的精油的總離子流譜圖。水蒸餾得到精油共檢測出 69 個成分，鑒定了占精油含量 %的 46 個成分（圖 31） 。亞臨界萃取得到精油共檢測出 57 個成分，鑒定了占精油含量 %的 50 個成分（圖 32）。各成分 鑒定結(jié)果見表 11， 12。 圖 31 水蒸餾提取孜然精油 GCMS總離子流圖 63 4 7 常用植物香料提取液對黃曲霉抑制效果的研究 13 圖 32 亞臨界萃取孜然精油 GCMS總離子流圖 2 4