ce分離條件的優(yōu)化方法(編輯修改稿)
2025-06-18 08:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 用紫外檢測方法 。 檢 測 條 件 紫外吸收是一種相當(dāng)成熟和可靠的檢測方法 ，有單波長 、 多波長 、 可變波長和波長掃描或二極管陣列等不同形式的檢測設(shè)計(jì) ， 它們各有優(yōu)劣：二極管陣列或波長掃描可以測定分離峰的紫外吸收光譜 ， 用于組分定性和純度鑒定 ， 但檢測靈敏度相對(duì)較低；可變波長檢測器 ， 能提供各種不同的波長 ， 以獲得選擇性檢測 ， 但檢測光線的能量一般較弱 ， 靈敏度居中；多波長或單波長僅能提供有限的波長 ， 但檢測靈敏度高 。 檢 測 條 件 在多數(shù)毛細(xì)管電泳中 ， 使用 200nm或205nm附近的檢測波長 ， 能對(duì)絕大多數(shù)的樣品提供高靈敏度的檢測條件 。 如果毛細(xì)管中填有凝膠 ， 則檢測波長需選在 210nm以上 ， 否則會(huì)因背景太強(qiáng)而測不出峰 。 紫外波長選擇參數(shù)可參見表 27, P64。 分離介質(zhì)選擇 分離介質(zhì)的選擇包括緩沖試劑、添加劑、溶劑、 pH、試劑濃度、篩分介質(zhì)、分配相等的選擇與優(yōu)化。這些參數(shù)的優(yōu)化與分離模式有關(guān)。現(xiàn)以 CZE介質(zhì)的選擇為重點(diǎn)進(jìn)行介紹，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)充介紹其他各模式介質(zhì)的選擇。 毛細(xì)管區(qū)帶電泳介質(zhì)選擇 毛細(xì)管區(qū)帶電泳是 CE中最基本的方式 ，其介質(zhì)的選擇與控制也是其他分離模式的基礎(chǔ) 。 毛細(xì)管區(qū)帶電泳介質(zhì)實(shí)際上是一種具有 pH緩沖能力的均勻的自由溶液 ， 通常稱為電泳緩沖液 （ Running buffer） ,簡稱緩沖液 （ Buffer） ,由緩沖試劑 、 pH調(diào)節(jié)劑 、溶劑和添加劑組成 。 緩沖液的選擇 ， 可分為 pH與緩沖試劑選擇 、 添加劑選擇等部分 。 pH 及其緩沖試劑 緩沖體系由緩沖試劑和 pH調(diào)節(jié)劑兩部分構(gòu)成 ，其中緩沖試劑的選擇主要由所需的 pH決定 ， 而pH則依樣品的性質(zhì)和分離效率而定 。 PH的選擇是決定分離成敗的一大關(guān)鍵 。 若樣品的解離常數(shù)已知 ， 可用公式進(jìn)行計(jì)算 ， 使組分間 181。em差別最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的 pH 就是理論最佳 pHm 。 凡pKa=pHm177。 181。em與樣品接近 、 無紫外吸收的化合物均可視為候選緩沖試劑 。 對(duì)候選緩沖試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定 ， 通常就能選出最佳試劑 。 pH 及其緩沖試劑 計(jì)算方法顯然很吸引人，但實(shí)際樣品的解離常數(shù)大多未知，做不了計(jì)算。此外， pH除控制弱電解質(zhì)樣品的有效淌度外，還控制著電滲甚至樣品在管壁上的吸附水平，這就難以計(jì)算了。如此，就必需通過實(shí)驗(yàn)的搜尋和優(yōu)化來選擇最佳 pH?？上扔昧姿峋彌_體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳） pH范圍后，再進(jìn)一步細(xì)選出更好 pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細(xì)管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低， pH緩沖范圍比較寬（ pH=～ 13），但電導(dǎo)也比較大。毛細(xì)管電泳中常用的緩沖體系還有硼酸或硼砂等，詳見表 28，P65。 pH 及其緩沖試劑 研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（ pH 2）或堿性（ pH＞ 9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在 pH=9～ 11之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在 pH=5～ 9之間選擇分離條件。 pH 及其緩沖試劑 pH 的選擇也和所用的毛細(xì)管種類有關(guān)，許多涂層毛細(xì)管只能在一定的 pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在 4＜ pH＜ 9的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。 pH 及其緩沖試劑 在相同的 pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。我們的經(jīng)驗(yàn)是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個(gè)典型的例子是，在分離糖類和 DNA等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。 pH 及其緩沖試劑 與緩沖試劑一樣， pH 調(diào)節(jié)劑也會(huì)顯著影響分離效率。由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質(zhì)，所以 pH 調(diào)節(jié)劑主要是堿類，常用的有KOH、 NaOH、 Tris等。如果這些堿不能給出理想的分離結(jié)果，則可以考慮使用胺或醇胺等有機(jī)堿，它們本身可以作為緩沖試劑（表 29， P66）。若緩沖試劑為堿類，則對(duì)應(yīng)的 pH調(diào)節(jié)劑即為酸，建議盡量采用弱酸。 pH 及其緩沖試劑 緩沖試劑及 pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在 10～ 200 mmol/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在 20 mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及 HEPES等，其濃度可在 100 mmol/L以上。有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（＞）的試劑濃度，此時(shí)要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。 添 加 劑 如果緩沖體系各種參數(shù)經(jīng)優(yōu)化后仍不能給出良好的分離結(jié)果 ， 就應(yīng)該考慮使用添加劑 。 最簡單的添加劑是無機(jī)電解質(zhì)如 NaCI、 KCI等 。 較高濃度的電解質(zhì)可以壓縮區(qū)帶 ， 甚至抑制蛋白質(zhì)等分子在管壁上的吸附 。 不過 ， 高濃度電解質(zhì)容易導(dǎo)致過熱 ， 使分離效率反而下降 。 過熱嚴(yán)重時(shí) ， 管內(nèi)會(huì)出現(xiàn)氣泡 ， 分離不能進(jìn)行 。 用兩性有機(jī)電解質(zhì)代替無機(jī)電解質(zhì)可克服過熱問題 。 在 pH=pI時(shí) ，兩性電解質(zhì)凈電荷為零 ， 不參與導(dǎo)電 。 實(shí)驗(yàn)證明 ，兩性電解質(zhì)是分離蛋白質(zhì)的有效添加劑 。 添 加 劑 還有三類重要的添加劑 ， 一是非電解質(zhì)高分子添加劑 ，
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