ce分離條件的優(yōu)化方法(已修改)
2025-05-29 08:26 本頁面
【正文】 毛細管電泳分離條件 選擇策略 概 述 毛細管電泳分離條件選擇的內(nèi)容很多，且與樣品、分離模式、檢測方式、進樣方法乃至儀器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等相關(guān)，但有許多共同之處，這里將對普遍性的問題進行考察，包括毛細管電泳模式選定、儀器操作條件確定、介質(zhì)選擇等。 毛細管電泳模式的選定 毛細管電泳有許多不同的模式 ， 因而在分離樣品前必需很好選擇分離模式 ， 以達到最佳的分離結(jié)果 。 毛細管電泳模式的選擇 ， 可以有不同的原則 ， 比如簡單性 、 目的性 、 普適性 、 選擇性 、 樣品特異性等 。 毛細管電泳模式的選定 以 簡單性為原則 時 ， 所選分離模式的操作 、 條件優(yōu)化 、 分離控制等必需是最簡單和最容易的 ， 而且富于后續(xù)變化 。 根據(jù)這一道理 ， 首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式 ，最后才考慮填充形式的分離模式 。 簡單性原則是毛細管電泳模式選擇的一般規(guī)則 。 毛細管電泳模式的選定 在分離生物樣品時 ， 通常需要根據(jù)分離的 目的 來選擇分離模式：欲測定樣品的尺寸 ， 就須選 NGCE或 CGE， 偶可選用 CZE或MEKC；要測定樣品的等電點 ， 則應(yīng)選用CIEF；在進行親和作用研究時 ， 則應(yīng)當(dāng)首先選用 ACE。 毛細管電泳模式的選定 我們的分析目的可能并不是單一的，這時的分離模式選擇，就應(yīng)該注意考慮其通用性 。 CZE、 MEKC 和 CEC 的通用性和可調(diào)節(jié)性都較大，但根據(jù)簡單性原則，還以 CZE 或 MEKC 為優(yōu)。注意，填充型毛細管電泳不適合于顆粒樣品的分離，甚至也不適合于大分子分離。 毛細管電泳模式的選定 有時 ， 我們會特別注重分離的 選擇性 ，即只希望把目標(biāo)組分分離出來 。 此時應(yīng)優(yōu)先考慮選擇性高的分離模式 ， 如 ACE等 。 如果已知樣品的某些特性 ， 也可以據(jù)此選擇分離模式 ， 比如在分離蛋白質(zhì)和多肽等兩性樣品時 ， 可以優(yōu)先考慮 CIEF；在分離中性分子時 ， 優(yōu)先考慮 MEKC；在分離水難溶組分時 ， 優(yōu)先考慮非水毛細管電泳形式等 。 毛細管電泳模式的選定 實際樣品五花八門 ， 性質(zhì)各異 ，分離模式的選擇是可變的和靈活的 。 這種靈活性恰好與毛細管電泳模式間的易換性相吻合 。 基本操作條件選擇 這里所謂的操作條件包括 ： 電泳電壓 、 溫度 、 毛細管尺寸 、 進樣 方法 、 檢測條件等 ， 下面分別討論之 。 電 泳 電 壓 理論和實驗均表明 ， 效率與電壓間存在極大值 。 極大電壓通常也是最佳工作電壓 。在實際分離中 ， 如果所用的毛細管很細或緩沖液的電導(dǎo)很低 ， 則極大電壓可能會超出儀器的控制范圍 ， 此時沒有最佳電壓 ，可選用儀器允許的最大輸出電壓 。 當(dāng)毛細管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時 ， 極大電壓有可能很小 ， 若此時的分離度很高 ， 也可以選擇大于極大值的電壓進行分離 。 電 泳 電 壓 極大電壓可以利用理論計算或?qū)嶒灉y定來獲得。利用理論效率方程，通過求極值的方法可以確定極大電壓。理論計算過程往往繁瑣，而且也不很可靠，通過實驗測定來確定工作電壓其實非常簡單。根據(jù)歐姆定律，電流和電壓具有線性關(guān)系，如能測定電壓與電流的關(guān)系曲線就不難確定工作電壓。 電 泳 電 壓 方法如下： ① 在電泳條件下 ， 改變電壓 （ 或電流 ） 測定對應(yīng)的電流 （ 或電壓 ） ； ② 做電壓～電流曲線； ③ 取線性關(guān)系中的最大電壓 （ 或電流 ） ， 作為分離電壓 （ 或電流 ） 。 線性以上的電壓 ， 焦耳熱效應(yīng)過大 ， 一般不宜選用 。 但如果分離效率很高 ， 就可以選用 ， 以便加快分離速度 。 在做 CGE時 ， 電場強度應(yīng)控制在 150～ 400V/cm之間 ， 否則容易導(dǎo)致凝膠的破壞 。 電 泳 電 壓 除工作電壓選擇外，還應(yīng)考慮電壓施加方式的選擇。理論上，毛細電泳可有恒流、恒壓、恒功率、梯度升（降）壓分離等不同的工作方式。目前，絕大多數(shù)分離采用瞬間升壓的恒壓工作方式。實際上，采用恒流工作方式有利于提高分離的重現(xiàn)性，在沒有良好恒溫控制的系統(tǒng)上進行電泳時，建議采用恒流或恒功率操作。經(jīng)驗表明，采用升壓（升流）分離，可以有效提高分離度，有條件時，應(yīng)當(dāng)充分考慮線性升壓的工作方式。在微量制備研究中，還需要考慮降壓分離過程，以便于餾分的準(zhǔn)確收集。 電 泳 溫 度 電泳溫度的選擇 ， 主要是指毛細管外表溫度的選擇與控制 。 溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性 ， 而且影響分離效率 。 溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制 、重現(xiàn)性控制 、 分離效率控制和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素 。 熱效應(yīng)控制旨在避免管內(nèi)溶液因過熱而出氣泡或沸騰 ， 顯然溫度越低越好；重現(xiàn)性控制意在避免溫度波動；分離效率控制的目的在于提高分離度 ， 依據(jù)樣品性質(zhì)的變化而高低不等 ， 需由實驗來測定 。 此外 ， 某些介質(zhì)對工作溫度有一定的限制 ，比如凝膠介質(zhì)不能適應(yīng)忽高忽低的溫度變化 ， 也不宜在過高或過低的溫度中電泳 。 電 泳 溫 度 多數(shù)情況下 ， 在 20～ 30℃ 之間進行電泳 ，就能獲得良好的分離結(jié)果 。 如若不然 ， 便需調(diào)整或優(yōu)化溫度 。 優(yōu)化多從室溫開始 ， 向上搜尋 ，若無結(jié)果 ， 再向下搜尋 。 不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境 ， 有些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件
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