全內(nèi)反射熒光顯微鏡(編輯修改稿)
2025-06-17 02:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。 ? 全內(nèi)反射熒光顯微成像法不再采用掃描成像 ,大大提高了成像速度 ,可以滿足實時成像的要求 。另一方面它的圖像解釋相對于近場 ,干涉顯微成像來說也較簡單。 ? 現(xiàn)在全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)已被廣泛用于 ? 實時觀察單個肌漿球蛋白分子的運動 ? 單個蛋白分子對之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 ( FRET) ? ATP 酶的翻轉(zhuǎn) ? 聚合物內(nèi)單個分子的結(jié)構(gòu)變化 ? 生物質(zhì)膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運動 ?全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展一方面會在加強傳統(tǒng)優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，即 動態(tài) 觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)、相互作用、物質(zhì)的分泌，同時在不斷的改進物鏡和CCD相機的性能基礎(chǔ)上進一步同其他儀器的結(jié)合，更多的用在生物細胞活體方面的研究。 1. 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù) 在生物單分子科學(xué)中的應(yīng)用 ? 單分子熒光探測主要有三個問題： ? （ 1）單分子發(fā)出的熒光信號通常是很 微弱的，所以要尋找一個足夠靈敏的探測器。 ? （ 2）由于拉曼散射，瑞利散射和雜質(zhì)熒光等產(chǎn)生的背景光，極大的 干擾 了信號光的探測。所以應(yīng)該盡量降低背景激發(fā)光。 ? （ 3）本體溶液產(chǎn)生的焦點熒光之外的 背景光 。 這些問題都可以利用全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng)來解決 全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以直接對細胞表面的過程進行觀測，而不受到來自細胞內(nèi)深層區(qū)域信號的干擾。 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是研究細胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù) 利用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察活細胞表面示意圖。 ? 單個的生物大分子的熒光分子特征和動態(tài)構(gòu)像變化要運用到 棱鏡型 的全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)。 ? 如用環(huán)境敏感熒光基團標(biāo)記的肌球蛋白，然后用分光鏡檢測。肌球蛋白分子上熒光基團發(fā)出的熒光光譜隨著時間的起伏現(xiàn)象，說明了自發(fā)的肌球蛋白單分子構(gòu)像改變。 ? 通過熒光標(biāo)記的分子共同定位運用全內(nèi)反射熒光顯微鏡對分子間相互作用可以直接觀察，熒光共聚焦能量轉(zhuǎn)移也能夠檢測到。 ? 分子伴侶蛋白 GroEL和伴侶輔助分子 (cochaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已經(jīng)在單分子水平進行了很好的研究。 ? 單配對熒光共聚焦也可以用在單分子水平生物大分子相互作用的成像。 ? 離子通道通過負責(zé)神經(jīng)，肌肉興奮性細胞的質(zhì)膜調(diào)節(jié)離子電流和電化學(xué)勢。 ? 單分子水平通道電流記錄可以通過使用膜片鉗方法來檢測各種通道的電特性。 ? 目前，已經(jīng)發(fā)展了一種同時可以測電流和熒光信號的實驗系統(tǒng)。熒光標(biāo)記的離子通道蛋白包埋到平面脂雙層中，然后用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察。利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)合后來發(fā)展的熒光共振能量轉(zhuǎn)移或者雙視角的光鏡可以看到離子通道與其配基或者調(diào)節(jié)子之間的相互作用，同時可以在體內(nèi)跟蹤構(gòu)像變化與離子電流。 ? 用于 DNA大分子在液 液、固 液界面的單分子吸附行為 。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡下拍到 的位于表面的 ActinYFP和 TubulinYFP蛋白分子圖 分別在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下（左）和 一般熒光顯微鏡（右）拍到的 Dilstainedneuron,細胞。 ? 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（ TIRFM）是研究 緊貼固體平面支撐物的細胞膜 的技術(shù)，但是正因為膜與固體支撐物具有相互作用，以及消逝波強度的指數(shù)性下降而導(dǎo)致單分子信號的指數(shù)性下降，使得對結(jié)果的解釋具有一定的困難性。 ? 因此將全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)與其它的顯微成像技術(shù)相結(jié)合來研究將是未來發(fā)展的一個新的方向。
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