上海師范大學(xué)植物生理學(xué)實驗(編輯修改稿)
2025-06-16 04:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ? 新鮮菠菜葉片 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗步驟 – 葉綠體色素的提取分離 ? 稱取新鮮葉片 2 g，放入研缽中加丙酮 5 mL，少許碳酸鈣和石英砂，研磨成均漿，再加丙酮 10 mL，以漏斗過濾之，即為色素提取液。 ? 把展層用的濾紙剪成 2 cm 20 cm 的紙條，將其一端剪去兩側(cè)，中間留一長約 cm，寬約 cm 的窄條。 ? 用毛細管吸取葉綠素溶液點于窄條的上方，注意一次所點溶液不可過多，風(fēng)干后再點，重復(fù)多次。 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗步驟 – 葉綠體色素的提取分離 ? 在大試管中加入四氯化碳 3～ 5 mL 及少許無水硫酸鈉。然后將濾紙條固定于軟木塞上，插入試管內(nèi)，使窄條浸入溶劑中（色素點要略高于液面），蓋緊軟木塞，直立于陰暗處進行層析。待四種色素帶清晰展開后，取出濾紙條，稍干后用鉛筆勾出色素帶邊緣。 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗步驟 – 葉綠體色素的理化性質(zhì) ? 葉綠素的熒光現(xiàn)象 取上述色素提取液少許于試管中，分別在反射光和透射光一側(cè)觀察提取液的顏色。 ? 銅代反應(yīng) 取上述色素提取液少許于試管中， 1 滴 1 滴加濃鹽酸，直至溶液出現(xiàn)褐綠色。然后加醋酸銅晶體少許，慢慢加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色。 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗步驟 – 葉綠體色素的理化性質(zhì) ? 黃色素與綠色素的分離 取上述色素提取液 10 mL，加到盛有 20 mL 乙醚的分液漏斗中，搖動分液漏斗，并沿漏斗邊緣加入 30 mL 蒸餾水，輕輕搖動分液漏斗，靜止片刻，溶液即分為兩層 。色素已轉(zhuǎn)入上層乙醚中，棄去下層丙酮和水，再用蒸餾水沖洗乙醚溶液 1～ 2 次。然后加入 5 mL 30% KOH甲醇溶液，用力搖動分液漏斗，靜置約 10 min，再加蒸餾水約 10 mL，搖動后靜置，則得到黃色素層和綠色素層。 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗結(jié)果 – 葉綠體色素的提取分離 ? 濾紙條自上而下的色素帶分別是 橙色的胡蘿卜素 黃色的葉黃素 藍綠色的葉綠素 a 黃綠色的葉綠素 b 葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)的鑒定 ? 實驗結(jié)果 – 葉綠體色素 的理化性質(zhì) ? 葉綠素的熒光現(xiàn)象 ? 銅代反應(yīng) ? 黃色素與綠色素的分離 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗原理 – 葉綠素和類胡蘿卜素都有光學(xué)特性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。 – 如果混合液中的兩個組分，它們的光譜吸收雖然有明顯的差異，但吸收曲線彼此有些重疊，可根據(jù) LambertBeer 定律，通過代數(shù)方法，計算一種組分由于另一種組分存在時對光密度的影響。最后分別得到兩種組分的含量。 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗原理 – 根據(jù) LambertBeer定律，最大吸收光譜峰不同的兩個組分的混合液，它們的濃度 C與光密度 OD之間有如下關(guān)系： OD1 = Cak a1 + C bk b1 OD2 = Cak a2 + C bk b2 Ca為組分 a的濃度（ gL－ 1）， Cb為組分 b的濃度（ gL－ 1）； OD1為在波長 λ1（即組分 a的最大吸收峰波長）時，混合液的光密度值， OD2為在波長 λ2（即組分 b的最大吸收峰波長）時，混合液的光密度值； ka1和 ka2分別為組分 a的比吸收系數(shù)， kb1和 kb2分別為組分 b的比吸收系數(shù) 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗原理 – 葉綠素 a和 b的 80%丙酮溶液的比吸收系數(shù) – 將數(shù)據(jù)代入上式經(jīng)整理后，并把濃度單位改為mg/L Ca = OD663 － OD645 Cb = OD663 － OD645 CT = Ca + Cb = OD663 ＋ OD645 波長 /nm 葉綠素 a 葉綠素 b 663 645 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗器材與試劑 – 實驗儀器 ? 分光光度計，離心機，臺天平，研缽，量筒，剪刀，移液管 – 實驗試劑 ? 丙酮，碳酸鈣， 石英砂 – 實驗材料 ? 新鮮菠菜葉片 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗步驟 – 稱取新鮮葉片 1 g，放入研缽中加丙酮 5 mL，少許碳酸鈣和石英砂，研磨成均漿，再加 80 % 丙酮 5 mL，將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用 80 % 丙酮洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管，離心后去沉淀，上清液用 80 % 丙酮定容至20 mL。 – 取上述色素提取液 1 mL，加 80 % 丙酮 6 mL 稀釋，轉(zhuǎn)入比色杯中，以 80 % 丙酮為對照，在 400～ 500 nm波長區(qū)每隔 10 nm，在 500～ 600 nm 波長區(qū)每隔 20 nm，在 600～ 700 nm 波長區(qū)每隔 10 nm，測定光密度，以繪制吸收光譜。另外測定 645 nm 和 663 nm 處的光密度，以計算葉綠素 a和 b的含量。 葉綠體色素的吸收光譜及葉綠素 a、b含量的測定 ? 實驗結(jié)果 – 吸收光譜 – 葉綠素 a和 b含量計算 波長 /nm 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 520 540 光密度 波長 /nm 560 580 600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 光密度 波長 /nm 645 663 光密度 離體葉綠體光還原反應(yīng) （希爾反應(yīng)） ? 實驗原理 – 在低溫下以等滲溶液制備完整的葉綠體，將其懸浮于適當?shù)姆磻?yīng)介質(zhì)中，并有氧化劑如 2，6二氯酚靛酚（簡稱 DCIP）存在時，在光照下會放出 O2，同時將染料還原，這就是葉綠體中進行的光還原反應(yīng)。染料被還原后，顏色從藍色變?yōu)闊o色，因此可根據(jù)溶液 OD 值的變化進行測定，該變化在 45 min 內(nèi)呈線性關(guān)系。 離體葉綠體光還原反應(yīng) （希爾反應(yīng)） ? 實驗器材與試劑 – 實驗儀器 ? 離心機，研缽，天平，紗布，試管， 100 W 燈泡，722型分光光度計 – 實驗試劑 ? 提取介質(zhì) 50 mmol/L（ ） TrisHCl 緩沖液（內(nèi)含 mmol/L 蔗糖、 1
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