【文章內(nèi)容簡介】 inal sequence and total amino acid position Pierce PVDF Membrane Western, Southern, Northern, and dot blots Pall Life Science BioTrace PVDF Transfer Membrane Nucleic acid and protein transfers. Protein sequencing $149 Invitrogen PVDF Membrane Protein sequencing, immunoblotting ￥ Whatman Westran Clear Signal PVDF Membrane Western blots 作為 PVDF 膜的鼻祖， Millipore 公司的 PVDF 膜 Immobilon系列分為ImmobilonP（ ） , PSQ(), FL(用于熒光顯色 )和 Blotting Sandwiches for High Troughput 四種。 ImmobilonP 膜孔徑均一，具有極強的吸附能力，染色性能好、抗溶劑能力強和信噪 比高，有助于提高檢測靈敏度，而且開放的孔結(jié)構(gòu)容易接近被吸附的蛋白質(zhì)，并有助于去除背景上沒有吸附的探針，可以說是免疫印跡檢測理想的印跡膜。 ImmobilonPSQ 轉(zhuǎn)印膜是印跡小分子蛋白質(zhì)（ 20KDa）的理想選擇 ——優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能，滲漏少。內(nèi)表面面積較大，可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測序的得率。由于不含污染性支撐物或表面活性劑，ImmobilonPSQ 層析譜上的背景峰值極小。 ImmobilonFL也是 Millipore 值得驕傲的產(chǎn)品，因為這是第一個專門為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。通過實驗證明，這種膜在 Kodak成像系統(tǒng)可以顯示僅 7ng的蛋白，聽起來不錯吧，有興趣可以試一試。這幾種膜除了一般的 PVDF 膜的優(yōu)點之外，最大特點就是一個字 ——快。按照 Millipore 的操作手冊， Immobilon可以在保證質(zhì)量的前提下縮短 WB 時間到 2個小時 ——主要是縮短封閉和洗脫時間。這可真是個好消息，因為坐在那兒等WB 結(jié)果多浪費時間??！縮短這個費時而枯燥的過程，早出結(jié)果，可以提高實驗效率，利于我們分析實驗結(jié)果，考慮下步對策嘛。卷膜經(jīng)濟實惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點雜交，而預(yù)裁剪的即用膜更適合高通量等等 ―用金錢換時間 ‖的 實驗。再次強調(diào)的是，疏水 PVDF 膜在用前必須經(jīng)過 50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用 MilliQ 水或者純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。 Invitrogen公司的 PVDF 膜也有大家風(fēng)范：膜是與兩張預(yù)裁的濾紙同時提供，方便使用；雖然一般而言 ，但 Invitrogen的 膜自有自家優(yōu)勢 ——特別適合于低背景，高敏感度的印跡反應(yīng)，同樣需要在乙醇或者甲醇，或者異丙醇中浸泡 5 分鐘就可以用了。 3. 尼龍膜 尼龍膜更多 是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡，比如 dot blot，比較于 NC膜來說，它的優(yōu)點是結(jié)合力強，特結(jié)實又柔軟且不易卷曲，機械強度大，便于操作，缺點是背景高 ——由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC 膜困難，對于靈敏度高的檢測方法，背景問題尤為突出（據(jù)分子克隆 III 說通過熱處理的酪蛋白和 1%聚乙烯吡咯烷酮延長封閉時間可以改善），而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有 SDS 時蛋白質(zhì)就容易從尼龍膜上泄漏（通過甲醛固定可以緩解這一情況）。另外至今也沒有適合尼龍膜上的直接染色方法。因此在許多情況下實驗室人員進行 WB 實驗 不選擇尼龍膜。 盡管如此，一些產(chǎn)品卻能 ―取其精華，去其糟粕 ‖，將尼龍膜一些不利于蛋白印跡的因素縮小或者去除，使其成為有效的蛋白轉(zhuǎn)移介質(zhì)。比如說，化學(xué)發(fā)光底物做得相當(dāng)出色的 Pierce 公司，其旗下的 Biodyne Aamp。B Nylon Transfer Membrane就是這樣一個產(chǎn)品。這種分為 A， B 兩型的尼龍膜做工精良，孔徑大小一致，為了保有尼龍膜高靈敏度的優(yōu)點和摒棄背景影響大的缺點， Biodyne 采用了合適的signaltonoise 比例來調(diào)整，從而達到了 200ug/cm2 的蛋白結(jié)合能力，同 時有比大多數(shù)尼龍膜甚至比一些 NC 膜都要小的低背景。除此之外， B 型的 Biodyne 對于一些帶負電蛋白是一種理想的轉(zhuǎn)移膜，因為它在 A 型的基礎(chǔ)上提高了正電荷集團的濃度。另外 Biodyne 相對于 NC 膜來說還是一種 ―打不怕，撕不爛，燒不著（ 200℃ 一下） ‖的 ―頑強 ‖的轉(zhuǎn)移膜。 電轉(zhuǎn)移和半干轉(zhuǎn)，以及轉(zhuǎn)膜的一些細節(jié)問題 續(xù)前：選好了膜，就該考慮如何做轉(zhuǎn)膜了。經(jīng)典的轉(zhuǎn)膜方法是電轉(zhuǎn)移，這個 生物通 在前面的 WesternBlot 儀器之選 里面有提到過，因為電轉(zhuǎn)移需要配套垂直電泳槽來進行。如何做這個 ―海綿 —幾層濾紙 —膠 —膜 —幾層濾紙 —海綿 ‖的 ―三文治夾心 ‖，在分子克隆上已經(jīng)有詳細的介紹，相信大家都很容易找到。一些細節(jié)： 1. 記得全程手套操作，一則避免手印污染影響結(jié)果，二則保護自己（未交聯(lián)的丙烯酰胺、甲醛等等雖不立即致命但都會 慢慢毒害你的身體，可不要這樣白白為科學(xué)獻身哈） 2. 如果 WB 前沒有可參考的資料 ——比如不知道是否有表達，比如抗體少還要摸條件（稀釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點雜交摸條件，省點時間省點試劑； 3. 去掉積層膠后，預(yù)染的 Marker 可用以識別膠上下方向和膜的正反面（預(yù)染 Marker 如果照著說明書用量，有可能在電泳時看不到條帶，但轉(zhuǎn)膜時有濃縮效應(yīng)而且背景白就可以看到了。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個用量，或者多加 1—2 倍的量）；如果目標(biāo)蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示劑已經(jīng)跑出去了，就要留 意分清膠上下方向，切個小角是常用的方法。膜上要做好標(biāo)記，識別正反面和上下。剪一個小小角最方便。膜和濾紙一起裁最好（不過濾紙上下疊多了膜不好剪，硝纖膜容易裂，用利刀 +尺子 +墊厚報紙劃比較容易）盡量和膠一樣大小，膠用純水沖洗一下后用電泳緩沖液平衡過再量。我自己通常剪的時候會故意長寬各比膠少 1mm，保證膜和膠不會碰到對方背后的濾紙就好。 4. 對于特別小的蛋白， tricine SDSPAGE 電泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD 間的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的濃度也不用太高（可參考 2020 年中國生物工程雜志上有一 篇文章（ 有效分離 1kD 小肽的TricineSDSPAGE 方法 ）， 87 年 ）。 5. 轉(zhuǎn)膜前膠要在轉(zhuǎn)移緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進一步去掉可能有礙轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測蛋白活性。 6. 膜漂在水面（或者甲醇 液面）讓液體從下通過膜上的孔滲上來以趕走膜內(nèi)空氣，膜徹底浸潤后顏色會變深一點，任何白點或者斑都是沒有完全浸潤的標(biāo)志，會影響轉(zhuǎn)膜的。最后浸沒入緩沖液里平衡。甲醇處理 PVDF 不要超過 15 秒。以后的步驟中不要讓膜干涸了，萬一不幸發(fā)生也用同樣處理。 7. 電轉(zhuǎn)移緩沖液通常用 Tris glycine 系統(tǒng)，如果是轉(zhuǎn)膜后有部分樣品要蛋白測序，最好用 CAPS 緩沖液，減少甘氨酸對測序的污染。 8. 半干電轉(zhuǎn)移（ SemiDry）用經(jīng)過緩沖液飽和的濾紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)移槽，非常節(jié)約試劑，而且效果也好。由于不用 ―泡 ‖在緩沖液中，半干轉(zhuǎn)不單可用均一 緩沖體系，也可以做非均一轉(zhuǎn)移緩沖體系（配方下面有，還可以加 20 % (v/v) 甲醇，據(jù)說有助于增加轉(zhuǎn)膜效率和減少膠變形的，但據(jù)說也有可能影響抗體識別）。半干轉(zhuǎn)可以在 30 分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)膜（每平方厘米電流—，恒流，冷庫。如果電流要求小可以延長到 60—90 分鐘，但要防止過熱。如果有那種溫度貼，可以貼上參考溫度），即使 205KD 這么大的蛋白轉(zhuǎn)膜效率也高達 80%。各種大小的蛋白的轉(zhuǎn)移效率都 OK。半干轉(zhuǎn)可以上下層疊 2 塊膠 +膜一起轉(zhuǎn)（面積還是按照單個計算），或者并排放（ 2 塊膠的面積計算），只要控制好單位 面積的電流強度和時間，防止過熱就好了。 Discontinuous blotting buffer to be used: Anode buffer I: 300 mM Tris Anode buffer II: 30 mM Tris Cathode buffer: 25 mM Tris/HCl (pH 9,4) 40 mM 6Aminocapronic acid 9. 10. 有人覺得轉(zhuǎn)膜加 SDS 有助于大分子蛋白轉(zhuǎn)膜，我個人持保留意見，因為SDS 等去垢劑影響硝纖膜和蛋白的結(jié)合，反而不好。 11. 如果只做 Western Blot，膜可以用麗春紅 S 染色并在脫色前照相，對后面的免疫反應(yīng)影響不大。不要用考馬斯亮藍或者氨基黑染色膜以免影響結(jié)果。如果有預(yù)染 Marker 需要用針或者筆扎眼記錄條帶位置，以免后面會洗掉而無法判斷結(jié)果。預(yù)染 Marker 也有助于判斷轉(zhuǎn)膜的效率和情況，如果比目標(biāo)分子大的 Marker 都已經(jīng)轉(zhuǎn)過去了，那就 OK 了。如果有能在Western結(jié)果顯色的 Marker（比如 生物通 前面特別推薦的 別出心裁 特別好用的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 誰可小看 ―蛋白標(biāo)準(zhǔn) ‖（下） ）就更方便了。 12. 有人說在中性條件下電泳有助于蛋白測序，如果要蛋白測序需 要提前一天倒膠，并說預(yù)電泳 6 小時（有還原劑如 Glycolate）后再倒積層膠。除了要做 HPLC 分析應(yīng)該用麗春紅 S 而不要用考馬斯亮藍或者氨基黑染色，其他的比如測序和或者 PTH 都可以選靈敏度高些的考馬斯亮藍或者氨基黑。沒條件做，參考而已。 13. 轉(zhuǎn)印后的 PVDF 膜在含 20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白條帶，有時這種快速的方法可以不用染色識別條帶，避免染色膜影響后繼實驗。 轉(zhuǎn)膜后的封閉注意： 14. 轉(zhuǎn)膜后，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。 Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好。 脫脂奶是最常用的經(jīng)濟配方（實驗太晚了還可以補充一下營養(yǎng)，哈哈），用這種封閉劑由于里面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，可能造成背景污染而不適合生物素 —親和素的檢測方法（如果用了生物素標(biāo)記的 Marker 而且結(jié)果背景較高，分析結(jié)果也有可能是受此影響），脫脂奶也不適合堿性磷酸酶檢測（ AP）方法。如果采用堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)，封閉劑最好用 6%酪蛋白 +1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸緩沖鹽加熱 65 度 1 小時確保堿性磷酸酶失活（可以加 %疊氮化鈉，新鮮最好）。經(jīng)濟的脫脂奶配方和 AP 兼容得不太好，再加上 HRP 的底物選擇范圍也更寬，現(xiàn)在 HRP 是越來越普遍的選擇。但是疊氮鈉 (NaN3)對辣根過氮化物酶 (HRP)有滅活作用，如果用 HRP 檢測系統(tǒng)則封閉液不要加疊氮化鈉為好。切記。封閉時間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，后面就全白忙活了。 15. 如果選用 AP 作為顯色方法，封閉時就要選擇 Tris 緩沖體系，不要用 PBS，因為 PBS 干擾 AP。再想起什么再補充吧。下一篇轉(zhuǎn)到顯色試劑的選擇了。 WB 蛋白印跡在生物化學(xué)這一塊是常規(guī)實驗，就像有人說炒菜中境界最高也最難的是蛋炒飯一樣，實驗中常規(guī)實驗也是很考驗技能的，除了潛心研究原理 、認真揣摩技巧以外，對于新實驗試劑的信息把握，勇于嘗試新方法也是非常之重要的 ——各大廠家都在不斷開發(fā)更方便更靈敏的新產(chǎn)品， ―idea 是生產(chǎn)力 ‖嘛，因此 生物通 這里介紹一些能把我們從日常操作中解脫出來，獲得 ―升級版 ‖效果 WB產(chǎn)品。 講完了 Western Blotting 的電泳轉(zhuǎn)移儀器，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和轉(zhuǎn)移膜之后，我們最后來探討一下 WB 的檢測系統(tǒng)。一般的 WB 檢測過程中，都會有封閉、一抗、二抗和底物顯 色這四道工序要 ―加工 ‖。我個人覺得底物顯色這最后一步是最關(guān)鍵的，也是最有文章可以作的一個部分。你看，光標(biāo)記方式就有生物素標(biāo)記，地高辛標(biāo)記，各種酶標(biāo)記等等，酶標(biāo)的底物又有各種生色底物、化學(xué)發(fā)光法底物和熒光底物可供選擇；就連識別一抗的配體也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，鏈親和素或者 Protein A 或 G 等，更別說各種試劑盒琳瑯滿目，叫人好像無從下手！不過不急， 生物通 幫你作個參考，讓你對各種產(chǎn)品 的優(yōu)點缺點一覽無遺，真正成為一個 WB 高手。另外如果實驗室有已經(jīng)建立的固定的顯色方法，那也沒關(guān)系，有時候不經(jīng)意瀏覽到的方法可能就會對你的實驗有莫大的幫助 ——這也就達到我們的目的了。 封閉和一抗的選擇沒有太多的選擇余地 ——封閉前面介紹過了；一抗？現(xiàn)在的抗體產(chǎn)品說明書一般都有注明應(yīng)用范圍的，說明可以用于 WB 的就 OK。如果沒有這些信息可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經(jīng)過 SDSPAGE 變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識別位點構(gòu)象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。如果還有多種抗體選 擇，那當(dāng)然是來源于兔或者小鼠抗體為好，因為后繼的檢測試劑盒一般都是針對兔鼠的居多，因而選擇范圍更大通用性也更強。除了無標(biāo)記的一抗，還有生物素等各種標(biāo)記一抗。還聽說有用熒光標(biāo)記的一抗直接檢