【正文】 底物作為生產原料。前不久 GE Healthcare 公司在 生物通 上發(fā)布了 ECL全系列的 65折特價優(yōu)惠，價格相當吸引，對于 ECL的忠實粉絲們實在不該錯過。發(fā)光時間的延長即使對于 X 底片的用戶也是好消息 ——因為壓片顯影后如果發(fā)現壓片結果不理想，還可 以多次重復壓片而不需要重新反應。目前最高檢測靈敏度已經達到低飛克（ Femto）級別而成為安全且靈敏度最高的 WB 檢測方法。 HRP 化學發(fā)光反應底物經過多個著名廠家的不斷研究開發(fā)而有了更顯著的改進。 DAB 還有溶劑形式的，便于使用。339。 底物 DAB 4CN AEC TMB 學名 3,3diaminobenzidine tetrahydrochloride 4chloro1naphthol 3amino9ethyl carbazol 3,3,5,5 tetramethylbenzidine 分子量 穩(wěn)定性 好 一般 避光 好 靈敏度 250pg 1ng 100pg 背景 一般 低 高 高 終產物成像性 不能很好的成像 容易成像 容易成像 顏色 褐色 介于藍色與藍紫色之間 （可用于 doublestaining） 棕紅色 藍紫色 毒性 有（疑有治癌作用） 無 有 無 最熟悉的底物應該是 339。 . HRP 辣根過氧化酶是最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯酶，由于 HRP 比活高、特異性更強、分子量?。?40kD）、穩(wěn)定和作用底物范圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。不過，二抗是更可靠的選擇 ——除了要選擇對應一抗的來源種屬，也要根據你準備采用的檢測方法選擇合適的標記。還聽說有用熒光標記的一抗直接檢測而降低背景和非特異結合，不過由于少了二抗的級聯放大信號擴增，信號也會比較弱，所以需要選擇熒光信號特別明亮的標記（ Invitrogen收購了著名的 Molecular Probes 后有推出 Alexa Fluor 的抗體標記試劑盒 ， 生物通 這里 有詳細而精彩的介紹，我們就不羅嗦了。 封閉和一抗的選擇沒有太多的選擇余地 ——封閉前面介紹過了；一抗？現在的抗體產品說明書一般都有注明應用范圍的，說明可以用于 WB 的就 OK。一般的 WB 檢測過程中，都會有封閉、一抗、二抗和底物顯 色這四道工序要 ―加工 ‖。再想起什么再補充吧。切記。 脫脂奶是最常用的經濟配方（實驗太晚了還可以補充一下營養(yǎng)，哈哈），用這種封閉劑由于里面可能有痕量的生物素和堿性磷酸酶，可能造成背景污染而不適合生物素 —親和素的檢測方法（如果用了生物素標記的 Marker 而且結果背景較高，分析結果也有可能是受此影響），脫脂奶也不適合堿性磷酸酶檢測（ AP）方法。沒條件做，參考而已。預染 Marker 也有助于判斷轉膜的效率和情況，如果比目標分子大的 Marker 都已經轉過去了，那就 OK 了。 Discontinuous blotting buffer to be used: Anode buffer I: 300 mM Tris Anode buffer II: 30 mM Tris Cathode buffer: 25 mM Tris/HCl (pH 9,4) 40 mM 6Aminocapronic acid 9. 10. 有人覺得轉膜加 SDS 有助于大分子蛋白轉膜，我個人持保留意見，因為SDS 等去垢劑影響硝纖膜和蛋白的結合，反而不好。如果電流要求小可以延長到 60—90 分鐘，但要防止過熱。 7. 電轉移緩沖液通常用 Tris glycine 系統(tǒng)，如果是轉膜后有部分樣品要蛋白測序，最好用 CAPS 緩沖液，減少甘氨酸對測序的污染。 6. 膜漂在水面（或者甲醇 液面）讓液體從下通過膜上的孔滲上來以趕走膜內空氣，膜徹底浸潤后顏色會變深一點，任何白點或者斑都是沒有完全浸潤的標志，會影響轉膜的。我自己通常剪的時候會故意長寬各比膠少 1mm，保證膜和膠不會碰到對方背后的濾紙就好。如果要電泳能看到就要參考電泳的那個用量，或者多加 1—2 倍的量）；如果目標蛋白小，指示劑也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示劑已經跑出去了，就要留 意分清膠上下方向，切個小角是常用的方法。 電轉移和半干轉，以及轉膜的一些細節(jié)問題 續(xù)前：選好了膜，就該考慮如何做轉膜了。B Nylon Transfer Membrane就是這樣一個產品。另外至今也沒有適合尼龍膜上的直接染色方法。卷膜經濟實惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點雜交，而預裁剪的即用膜更適合高通量等等 ―用金錢換時間 ‖的 實驗。通過實驗證明，這種膜在 Kodak成像系統(tǒng)可以顯示僅 7ng的蛋白，聽起來不錯吧，有興趣可以試一試。 ImmobilonPSQ 轉印膜是印跡小分子蛋白質（ 20KDa）的理想選擇 ——優(yōu)良的蛋白質吸附性能，滲漏少。 PVDF 膜特別注意的是需要 100%甲醇預處理（不超過 15 秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理（不過要真出現這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉膜前處理也就罷了，轉膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識別呢）。特別是需要做 N 端蛋白測序，在相當 ―嚴酷 ‖的清洗條件下，當尼龍或者硝纖膜已經降解的情況下 PVDF 膜依然保持本色，笑傲江湖。與硝酸纖維素膜相比， PVDF 膜在蛋白質截留能力，機械強度和化學相容性上都更優(yōu)越的性能（ Pluskal,et al.,1986)。不過，卷膜肯定是最實 惠的選擇，只不過要自己動手裁剪 ——切記，必須帶手套操作。 Optitran是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上 100%純的硝酸纖維素，結果表面看起來和純硝纖膜 完全一樣，保持了 NC 膜各種優(yōu)點，只是內部多了一層中性支持物，大大增強這種強化 NC 膜的柔韌度和機械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特別是重復標記和洗脫的實驗。如果 NC 膜攙雜一些醋化纖維素 ——這在前面已經提到，會影響蛋白質結合。 Schull 的名字拗口 ——那大概需要舌頭在口腔里經過若干次不同弧度和不同速度的上下往返精確運動再配合適當的吐氣才能讀得準確優(yōu)雅，不過作為第一個提供硝纖膜的廠家依然廣為人知，其 NC 膜分為純NC 膜和強化 NC 膜兩種： Protran nitrocellulose membrane 和 Optitran nitrocellulose membrane。另外提醒一句：由于 NC 膜上結合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過 %（據說 %效果最好）。 Schull 公司的一個實驗表明，轉移到 NC 膜上的幾種蛋白 4 度條件下保存 5 年依然保持免疫識別特性，依然可以得到清晰可信的 Western Blot 結果。 首先來比較下這 幾種膜的特點 NC 膜 尼龍膜 PVDF 膜 靈敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 較高 低 結合能力 80－ 110 ug/cm2 400 ug/cm2 125－ 200 ug/cm2（適合于 SDS 存在下與蛋白質的結合） 材料質地 干的 NC 膜易脆 軟而結實 機械強度高 溶劑耐受性 無 無 有 操作程序 緩沖液潤濕 ,避免氣泡 緩沖液潤濕 使用前 100%甲醇潤濕 檢測方式 常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測 不能用陰離子染料 常規(guī)染色 ， 比較于 NC 膜，可用考馬斯亮藍染色，可用于 ECL 檢測，快速免疫檢測。 Western Blotting 亦是如此，沒有選擇好合適的轉移膜是無法做出漂亮的結果的。所以最經濟實惠的方法是：麗春紅 S，直接染色轉移膜，檢測轉膜效果，充分脫色后不干擾 Western結果。銀染操作復雜一些但分辨率高很多，可以分辨 25ng蛋白。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復使用電泳 Buffer（別小氣，重復使用會降低緩沖能力的），好像基本不會出問題了。水要用去離子的純水， MilliQ 級 更好。 除此之外，六一還有中型和大型電泳儀以及半干式轉移槽，比如 DYCZ24B加寬雙垂直電泳槽， DYCP40C 型半干式碳板轉移槽，都不錯。而且使用方便、可靠。再比如凝膠大小為 1816cm的SE600 Ruby，以及為了蛋白質組學研究的需要開發(fā)的 Ettan DALT six 和 Ettan DALT twelve，這兩種電泳系統(tǒng)分別可以進行 6 塊和 12 塊凝膠的電泳，這可以說是 ―庫斯拉級 ‖的電泳系統(tǒng)??！ 三、國產品牌 在儀器器械產品領域，北京市六一儀器廠（北 京沃德生物醫(yī)學儀器公司）歷時 30 多年，在眾多進口品牌的圍攻之下仍巍巍挺立，未見衰落，可見其產品品質是經得起風雨洗禮的。 MiniVE 與一般蛋白電泳相比，有個很大優(yōu)勢，就是其蛋白膠可薄至 ，而且凝膠大小是 10(WH)，比一般的 108cm要長了 30%，這樣的好處就是增加了蛋白分辨率，使一些 ―難舍難分 ‖的蛋白組分 ―分道揚鑣 ‖，達到更好的分離效果。裝玻璃的時候如果傳統(tǒng)的 ―插進模塊 ‖就容易導致Spacer 和玻璃之間 ―走位 ‖， MiniVE 的模塊兩個側邊和底部都可以打開，將裝好的玻璃平放，合上夾邊再擰螺絲就行；底部的封邊也很特別，有 3 檔，一個是 密封檔，可以密封底邊后直接倒膠；一個是半開的電泳檔，允許電泳液均勻連通膠底部，另一個當然就是完全打開以便裝卸玻璃了。 MiniVE 配膠過程就三步： load→ clamp→ca st，只需把玻璃板放上去，夾緊，然后灌膠就完事了。所以如果你剛開始接觸蛋白電泳和 Western印跡，那么可以考慮一下 GE 公司（ Amersham）的產品，因為這些產品不僅購買放心，而且在產品服務方面也相當不錯，能夠找到眾多有用的資料。老實說 GE 的這一單向電泳系列一直算是良心價，和美國 Hoefer 的價格差不多，如果算上這么大的折扣優(yōu)惠，在美國也買不到這個價格呢！ GE（通用電氣公司）有一個很有名的創(chuàng)始人 ——托馬斯 二、電泳世家 Hoefer 也許國內的研究人員不那么熟悉 Hoefer，但是這個 1967 就成立的公司在電泳產品領域可謂赫赫有名。現在那個超薄硬質玻璃板也可以單買了，以前可是十套打包的。第三，就是Mini TransBlot 的冷卻裝置。第一就是在夾板盒，由于轉膜過程中的氣泡問題對于實驗結果有很大的影響 ——試想一下，在特異帶顯色處正好有一個氣泡，那么本來可以很漂亮的結果就付之一炬了 ，甚至可能會造成假陰性結果。l)， IPG b (7 cm IPG strip)。l)， 15well (15 181。MiniPROTEAN 3 體現了 BioRed 不斷改進的努力方向 ——設計人性化，令操作更簡便 ——這在各個細節(jié)都可以體現，比如說為了防止制膠過程出錯， Mini 在玻璃板，夾合器（固定玻璃板的裝置）以及電泳槽里等處分別都有注明正反位、夾 板高度或正負極；方便的夾子取代了以前需要擰 4 個螺絲來固定玻璃板的麻煩。 Mini Protein Cell 的出現使得 Western的制膠和電泳的消耗成本更經濟、操作更簡便快速 ——這種簡便也間接促進了Western技術的更廣泛采用。只要是提到 SDSPAGE， BioRad 絕對是每個實驗室首先考慮的品牌，經典就是經典呀。 Western 印跡的儀器主要就是電泳系統(tǒng)和電轉移系統(tǒng)了，最好的品牌當然是BioRad 和 Amersham（ GE Healthcare）的 Hoefer 系列了，現在國內出品的物美價廉的電泳系列產品，也是不錯的選擇，幾乎每個實驗室都需要至少一套 Mini Cell 吧？如果還沒有你該怎么挑選呢。Western 技術大全 from 生物通 技術專題：既可以定性，又可以半定量的 Western是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。 ―工欲善其事 ，必先利其器 ‖，要想有好的實驗結果，好儀器是相當重要的，因此讓我們先來看看什么樣的儀器能讓我們無后顧之憂，順利痛快的一步到位。 BioRad 生命科學部產品包括蛋白組研究產品、層析儀與填料、蛋白質和核酸電泳產品等，不過最為普通實驗室熟悉的莫過于蛋白電泳 Mini 系列和層析儀。而且在操作手段方面也越來越簡便，越來越準確。由于MiniPROTEAN 3 可以用于 SDSPAGE 變性電泳、非變性電泳、 TricTricine 電泳、等電聚焦和酶譜分析，以及 dsDNA、 ssDNA 和 RNA 的電泳分離，因此可以說只要實驗室有一套 MiniPROTEAN 3，足以應付常規(guī)垂直電泳需要了。除此之外， Mini 的加樣容量也是可以多樣選擇的，包括 10well (30 181。l)， 9well (30 181。說它好，當然是有原因的，由于 Mini TransBlot 在轉移過程當中的三個關鍵步驟里設計巧妙，幫助轉移順利進行，提高了轉膜效率，因此才會得到如此多的用戶的贊賞。試問一下，在轉膜中最怕什么，我想大部分人都會說是正負極弄錯， Mini TransBlot 為了防止這種造成整個實驗完全失敗的情