高粱木質(zhì)素突變株b743生物學(xué)特性分析(編輯修改稿)
2024-10-07 18:33 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)量； 106— 樣品質(zhì)量單位由 g換算成 μg的倍數(shù)； 圖 1， 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 , Glucose curve of starch 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外吸收法 [7]。 蛋白質(zhì)溶液在 280nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。核酸對(duì)紫外也有吸收，但其最大吸收 峰在 260nm波長(zhǎng)處，故可通過(guò)校正加以消除。 稱取烘干、粉碎的高粱種子 ，放入研缽中，加入 30%NaOH溶液及少量石英砂研磨 2min，再加入 60%堿性乙醇溶液研磨 5min。然后用 60%堿性乙醇溶液將研磨好的樣品全部轉(zhuǎn)入 25mL容量瓶中定容。搖勻后靜置片刻，再取部分提取液離心10min(3500r∕min)。吸取離心后的上清液 25mL容量瓶中，用 60%堿性乙醇溶液定容，搖勻后即可用于測(cè)定。 取適量稀釋后蛋白質(zhì)提取液，在紫外光分光光度計(jì)上， 以 1 cm光徑的石英比色 杯 分別 在 280nm和 260nm波長(zhǎng)條件下（ 空白對(duì)照為 樣品提取液）測(cè)定其光吸收值，然后根據(jù)所測(cè)得的光吸收值，代入公式計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。 樣品中的蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)=A260 樣品中蛋白質(zhì)含量 (%)=(A260)稀釋倍數(shù) 100/1000 式中： ； A280為蛋白質(zhì)提取液在 280nm波長(zhǎng)處的吸光度值； A260 5 為蛋白質(zhì)提取液在 260nm波長(zhǎng)處的吸光度值； 100/1000為蛋白質(zhì)濃度換成成百分?jǐn)?shù)。 種子蛋 白質(zhì)組分的分析 利用不同性質(zhì)的蛋白溶解在不同的提取液中，再通過(guò)紫外吸收法測(cè)定各類蛋白含量[7]。 清蛋白的提取 [7] 取 1g烘干的高粱種子，研磨成細(xì)分，放入 25mL具塞磨口三角燒瓶，加 10mL蒸餾水放入 THZC恒溫振蕩器提取 2h后靜置 ， 4000r/min，取其上清液，將殘?jiān)喜⒂谠瞧恐校?再 分別用 50mL和 30mL蒸餾水重復(fù)振蕩 后 離心，合并上清液， 合并 剩余殘?jiān)谠瞧恐小? 球蛋白的提取 [7] 在三角瓶中，加 100mL ，放于 THZC恒溫振蕩器上振蕩提取 2h后靜置 ， 4000r/min，取其上清液，殘?jiān)喜⒂谠瞧恐?，在分別用50mL和 30mL ，合并上清液， 合并 剩余殘?jiān)谠瞧恐小? 醇蛋白的提取 [7] 在三角瓶中，加 100mL 70%乙醇溶液，放于 THZC恒溫振蕩器上振蕩提取 2h后靜置 ， 4000r/min，取其上清液， 殘?jiān)喜⒂谠瞧恐?，在分別用 50mL和 30mL 70%乙醇重復(fù)振蕩提取離心，合并上清液， 合并 剩余殘?jiān)谠瞧恐小? 谷蛋白的提取 [7]在三角瓶中，加 100mL 70%乙醇溶液，放于 THZC恒溫振蕩器上振蕩提取 2h后靜置 ， 4000r/min，取其上清液， 合并 殘?jiān)谠瞧恐?，在分別用 50mL和 30mL ，合并上清液。 用蒸餾水 將上述四組離心后的上清液定容至 250mL，用各自 提取液作對(duì)照 用 TU1810紫外可見(jiàn)光光度計(jì) ，分別在 280nm和 260nm波長(zhǎng) 下測(cè)定其吸收值。 按下面公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)濃度 ： 樣品中的蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)=A260 樣品中蛋白質(zhì)含量 (%)=(A260)稀釋倍數(shù) 100/1000 式中： ； A280為蛋白質(zhì)提取液在 280nm波長(zhǎng)處的吸光度值； A260為蛋白質(zhì)提取液在 260nm波長(zhǎng)處的吸光度值； 100/1000為蛋白質(zhì)濃度換成成百分?jǐn)?shù)。 淀粉含量測(cè)定 高氯酸水解 蒽酮比色法 [8]測(cè)定淀粉含量。用乙醇溶液 除去 樣品中的可溶性糖，再用高氯酸溶液溶解殘留物中的淀粉，使淀粉與其他成分分離，在濃硫酸的作用下， 淀粉與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色化合物，在 640 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 吸光度 。 試劑配制： 52％高氯酸溶液； 80％乙醇溶液；蒽酮試劑 （ 將 100mL 88％硫酸溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配 ） ；淀粉標(biāo)準(zhǔn)液 （ 將 200mg淀粉倒入 100mL燒杯中，加入 5mL蒸餾水，加入 65 mL52％高氯酸溶液，攪拌溶解，加水定容 至 100mL，濃度 2mg／ mL；取上述標(biāo)準(zhǔn)淀粉溶液 250mL， 即 為 80ug／ mL） 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取潔凈 試管，分別加入 、 、 、 、 、 ug 淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，每一個(gè)濃度 2個(gè)重復(fù)，加 蒸餾 水 使 各試管均為 mL， 冰水中冷卻 2 min，加入 mL蒽酮 試劑 ，搖勻， 置 冰水中冷卻 2 min。再置 沸水中 水浴 5 min，取出試管， 自然 冷卻至室溫 。 用 mL 蒸餾水按照上述操作作為空白參比，于 640nm 波長(zhǎng)下比色，測(cè)定各試管溶液的吸光度 。 以吸光度為橫坐標(biāo)，淀粉濃度為縱坐標(biāo)，繪制 標(biāo)準(zhǔn) 曲線，進(jìn)行曲線擬合 。 操作步驟：稱取研碎的子粒粉末 10 mL離心管中，其中包括 2個(gè)重復(fù)， 加 2滴80％乙醇溶液使樣品濕潤(rùn)，再加 1 mL 水搖勻，加入 5 mL 熱的 80％乙醇溶液 ， 搖勻后靜置 5min后， 3000r/min離心 5 min， 傾出上清液 . 再用 6mL 80％乙醇溶液重復(fù)提取 1次。 向上述殘 留物中加入 5 mL水和 6mL 52％高氯酸溶液， 振蕩 10 min，以 3000r/min離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)入 20 mL 溶量瓶中，殘留物再用 7 mL 52％高氯酸溶液提取，合并提取液 ， 6 過(guò)濾，棄去最初 mL 濾液 。 吸取 mL濾液加水定容 25mL溶量瓶中，取上述淀粉提取液 mL在 640 nm 波長(zhǎng)下 吸光度。 y = R2 = 01020304050607080900 吸光度 OD濃度（ug/ml） 圖 2， 淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線 , Standard curve of starch 葉綠素（ Chl）含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用丙酮提取分光光度法測(cè)定 [7]。 稱新鮮高 粱葉片，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈）混勻。 稱取 去中脈后 剪碎的新鮮 葉片 ， 共三份，在這里仍然是每組濃度下三個(gè)重復(fù)，并不能缺少對(duì)照組，分別放入研缽中，加少量 碳酸鈣粉和 石英砂及 23mL80%丙酮研成漿狀，再加 80%丙酮 10mL繼續(xù)研磨至組織變白。靜置 35min。 取 一張 濾紙，置于漏斗中，用丙酮潤(rùn)濕，沿著玻璃棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25mL棕色容量瓶中，用少量 80%丙酮沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小? 用滴管吸取丙酮，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)?無(wú)綠色為止。最后用丙酮定容至 25mL。 分批提取葉綠素，把葉綠體色素提取液倒入光徑 1cm的比色杯內(nèi)。以 95%丙酮作對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定 665nm和 649nm下的吸光度 [7]。 按下列公式求出葉綠素濃度： Ca= Cb= 葉綠素總濃度 C=Ca+Cb 求得葉綠素總濃度后按下列公式計(jì)算葉綠素的含量： 葉綠素含量 (mg/g)=CVN103/W 式中： C為葉綠素濃度 (mg/L)； V為提取液體積 (mL)； N為稀釋倍數(shù)；
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