【文章內(nèi)容簡介】 l DNTP l Taq酶 l dd 水 μ l 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)參照劉國慶 [7]的方法，略作改動(dòng)： PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性 5min, 循環(huán) 95℃變性 30s、退火 1min、 72℃延伸 2min, 共 35 個(gè)循環(huán) , 最后在 72℃延伸 10min。 PCR 產(chǎn)物用 8%的凝膠工作液電泳分離 , 銀染顯色（其 8%的凝膠工作液和銀染試劑的配制見表 2）。 8%的凝膠工作液配制 成分 /溶液體積 20 40 60 80 100 超純水 /ml 14 28 42 56 70 10 TBE/ml 2 4 6 8 10 40%貯液 /ml 4 8 12 16 20 TEMED/μ l 20 40 60 80 100 10%AP/μ l 200 400 600 800 1000 銀染過程藥品 配制 成分 /溶液體積 ml 100 150 200 250 300 硝酸銀 /g 顯色液 氫氧化鈉 /g 3 甲醛 40%/ml 1 2 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物以 0、 2 建立數(shù)據(jù)庫，在相同的標(biāo)記位置上， 抗蚜的條帶標(biāo)記為 1，感蚜的條帶標(biāo)記為 0，具有雙親的雜合體條帶標(biāo)記為 2，沒有條帶或者模糊不清的條帶忽略不計(jì)（記為 *），其中鑒定結(jié)果 B 表示感蚜， A 表示抗蚜。根據(jù)趙雪梅，劉太峰，李云靜等人用人工 去雄方法，利用抗蚜 x 感蚜、耐蚜 x 感蚜、感蚜 x 感（注： TEMED 作用是促進(jìn)凝固，應(yīng)先加， AP作用是凝固，應(yīng)后加） 蚜等組合的雜交后代和回交后代，對(duì)高粱品種抗蚜的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明，高粱的抗蚜基因?qū)Ω醒粱虮憩F(xiàn)顯性，受主效單基因控制 [8]。因此在存在雜合體的引物中，以抗蚜為表現(xiàn)性狀。 2 結(jié)果與分析 模板 DNA 質(zhì)量檢測 用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的 DNA 進(jìn)行檢測 , OD260/OD280 的比值處于 ～ 之間 , 表明提取的 DNA 樣品純度比較高 , 少部分 DNA 樣品有輕微的蛋白質(zhì)或 RNA 污染。 多態(tài)性引物的篩選 根據(jù)上述兩親本 間多態(tài)性引物的篩選結(jié)果和觀察，表明：所擴(kuò)增的條帶清晰、分辨率高、重現(xiàn)性好、多態(tài)性強(qiáng)，是較適宜的擴(kuò)增體系（見下圖 1）。 數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 株系編號(hào) sb6m3174 sb6m3500 sb6m3610 sb6rj2776 sb6rj2880 引物G5Q5 表型調(diào)查 鑒定結(jié)果 1 0 0 0 2 0 0 A A 2 0 0 0 0 0 0 B B 3 1 1 1 1 1 1 A A 4 0 2 * 0 0 0 A A 5 0 0 0 2 * 0 A A 6 0 0 0 0 0 0 B B 7 0 0 0 0 1 1 A A 8 1 1 * 1 1 1 B A 9 2 2 0 2 2 0 A A 11 1 1 1 1 1 1 B A 12 2 2 0 2 2 0 B A 13 0 0 0 2 0 0 B A 14 1 0 * 1 1 1 B A 15 0 1 0 0 0 0 A A 16 0 1 0 0 0 0 A A 圖 1：親本引物條帶電泳結(jié)果 17 0 0 0 0 0 0 B B 18 0 0 0 0 0 0 A B 19 1 1 1 1 1 1 A A 20 1 1 1 1 1 1 B A 21 0 0 0 0 0 0 A B 22 0 2 0 2 0 0 B A 23 0 0 0 2 0 0 A A 24 2 2 0 2 2 2 B A 25 1 1 0 1 1 0 A A 26 0 0 0 0 0 0 A B 27 0 0 0 0 0 0 B B 28 1 1 1 1 1 1 A A 29 2 1 2 2 1 2 A A 30 1 1 1 1 1 1 B A 31 0 0 0 2 0 0 B A 32 2 2 0 2 2 0 A A 33 1 1 1 1 1 1 A A 34 1 1 1 1 1 1 A A 35 0 0 0 2 0 0 A A 36 0 0 0 2 0 0 B A 37 1 1 1 1 1 2 B A 38 1 1 1 1 1 1 A A 39 0 0 0 0 0 0 A B 40 0 0 0 0 0 0 A B 41 0 0 0 0 0 0 B B 42 0 0 0 2 0 0 B A 43 1 1 1 1 1 1 A A 44 0 0 0 2 0 0 A A 45 1 0 1 1 1 0 B A 46 1 0 1 2 2 0 B A 47 2 0 * 2 * 0 A A 48 1 1 1 1 1 0 A A 49 2 0 0 2 0 0 B A 50 0 0 0 0 0 0 A B 51 0 2 0 2 0 0 B A 52 0 0 0 0 0 0 B B 53 0 0 0 0 0 0 B B 54 2 1 0 2 1 0 A A 56 0 0 0 0 0 0 B B 57 1 1 0 0 0 0 A A 58 0 0 0 0 0 0 B B 59 0 0 0 0 0 0 A B 60 1 * * 1 1 1 A A 61 0 0 0 0 0 0 B B 62 1 0 * 1 1 1 A A 63 0 0 0 0 0 0 B B 64 2 1 0 0 0 0 B A 65 0 1 0 0 0 0 B A 66 0 1 0 0 0 0 A A 67 0 * * 1 * * B A 68 0 0 0 0 0 0 B B 69 0 0 0 1 * 0 B A 70 1 0 1 1 * 1 A A 71 1 1 0 0 0 0 B A 72 0 1 0 0 * 0 A A 73 0 0 0 0 0 0 B B 74 0 0 0 0 0 0 A B 75 0 0 0 0 0 0 A B 76 1 1 1 1 1 1 B A 77 2 0 0 2 2 0 A A 78 1 1 1 1 1 1 A A 79 2 1 0 2 2 0 A A 80 0 0 0 0 0 0 B B 82 0 0 * 2 * 0 B A 83 0 0 * 0 0 0 A B 84 1 1 1 1 1 1 B A 85 1 1 * 1 1 1 A A 86 1 1 1 1 1 1 A A 87 0 0 0 0 0 0 B B 88 0 0 0 2 2 0 A A 89 0 0 0 0 0 0 B B 90 2 1 0 2 2 0 A A 91 0 0 0 0 * 0 B B 92 0 0 0 0 1 1 B A 94 * 0 0 2 1 0 B A 96 0 0 0 0 0 0 B B 98 0 0 0 0 0 0 B B 99 0 0 0 0 0 0 B B 100 0 0 0 0 * 0 B B 101 0 0 0 0 0 0 B B 102 0 0 0 0 0 0 B B 103 0 0 0 0 0 0 A B 104 0 0 0 2 0 0 B A 108 0 0 0 0 0 0 B B 109 1 1 1 1 1 1 A A 110 1 1 1 2 1 1 B A 111 0 0 0 0 0 0 B B 112 0 0 0 0 0 0 B B 113 0 0 0 0 0 0 B B 114 0 0 0 0 0 0 B B 115 1 1 1 1 1 1 A A 116 0 0 0 0 0 0 B B 117 2 2 0 2 2 0 A A 118 0 0 0 0 0 0 B B 121 0 0 0 0 0 0 B B 122 1 1 1 1 1 1 B A 123 0 0 0 0 0 0 A B 124 0 0 0 0 0 0 B B 125 2 0 0 2 2 * A A 127 0 0 0 0 * 0 B B 128 0 0 0 2 0 0 B A 129 2 0 0 2 2 0 A A 130 2 0 0 2 2 0 A A 132 1 1 1 1 1 * A A 133 0 0 0 2 0 0 B A 134 0 0 0 0 0 0 B B 135 0 0 0 0 0 0 B B 137 2 0 0 2 2 2 A A 138 0 0 0 0 0 0 B B 139 0 0 0 0 0 0 B B 140 1 1 1 1 1 1 A A 141 0 0 0 0 0 0 B B 142 0 0 0 0 0 0 B B 143 0 0 0 0 0 0 B B 144 0 0 0 0 0 0 B B 抗蚜鑒定結(jié)果 通過對(duì)高粱中這 5 對(duì)引物以及對(duì)高粱群體田間表型的調(diào)查，田間表型調(diào)查結(jié)果中有表現(xiàn)抗蚜的有 59 株，感蚜的有 85 株。 在對(duì)引物進(jìn)行凝膠電泳后的結(jié)果鑒定中，可以發(fā)現(xiàn)其中植株表現(xiàn)為抗蚜的有 79株，感蚜的 65 株。 用 Mapmaker 對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行計(jì)算 , 用 Kosambi 函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(見圖 4)。結(jié)果顯示 , 表型抗蚜具有與抗親一致的分子標(biāo)記，能夠用分子標(biāo)記對(duì)高粱重組自交系群體進(jìn)行抗蚜性鑒定。 3 討論 在凝膠電泳的結(jié)果和田間表型調(diào)查作比較，發(fā)現(xiàn)一些存在有抗性 基因的植株，在表型上卻表現(xiàn)為感蚜，而另外一些具有感蚜引物的植株，卻表現(xiàn)為抗蚜，其可能原因分析如下： 高粱植株的物理性狀與抗蚜性的關(guān)系 通過田間調(diào)查和室內(nèi)分析 ,研究了不同基因型高粱對(duì)高粱蚜的抗性及其與高粱物理性狀間的關(guān)系。結(jié)果表明 ,高粱的抗蚜性屬顯性遺傳。高粱抗、感基因型間的蠟質(zhì)含量、葉片顏色、葉片表面結(jié)構(gòu)均存在差異?？寡疗废档南炠|(zhì)含量和葉綠素含量均低于感蚜品系 ,并且葉片表面光滑 ,細(xì)胞排列整齊致密 [12]。 因此某些葉片蠟質(zhì)層含量高的 不同溫度下對(duì)高粱植株抗蚜性的影響 圖 2：田間調(diào)查時(shí)觀察到高粱葉片的抗感情 況 圖 4：分析連鎖圖 圖 3：凝膠電泳結(jié)果條帶 在高粱蚜蟲大發(fā)生時(shí)期 ，由于蚜蟲繁殖量較大，會(huì)對(duì)高粱植株造成嚴(yán)重危害，某些抗蚜的植株也可能會(huì)由收到危害。 隨著氣溫的升高，從 5 月下旬開始田間高粱苗陸續(xù)出土并見長。同時(shí)在越冬寄主上的有翅蚜向高粱田遷移，遷移時(shí)間能一直持續(xù)到 7 月上旬，但尚有一部分高粱蚜居留于狄草上。在東北地區(qū)，高粱蚜是高溫干旱條件下發(fā)生嚴(yán)重的害蟲，自 6 月中旬至 7 月中旬，平均氣溫在 2229℃，旬平均相對(duì)濕度在 55%75%，溫度系數(shù)（旬雨量 /旬平均氣溫）大多在 1 以下，是大發(fā)生的主要條件。 高粱抗蚜性基因的表達(dá)受環(huán)境的影響 性狀表現(xiàn)是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用 的結(jié)果， 用 Cry1Ab/Cry1Ac 板式試劑盒測定了不同光照時(shí)間、不同溫度和不同水平氮肥處理下 ,Cry1Ab 蛋白在轉(zhuǎn)基因高粱中的表達(dá)水平。結(jié)果表明 ,不同光照長度處理的 Cry1Ab 蛋白含量有較大差異 ,其順序?yàn)?12 h16 h18 h14 h10 h。不同溫度處理對(duì) Cry1Ab 蛋白含量也有較大差異 ,為 25℃ 30℃ 20℃ 35℃ 40℃ 。不同施肥水平下對(duì) Cry1Ab 蛋白量也有較大影響 ,作基肥的以 300 k 純氮效果最佳 [15]。 人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也具有很大方面的影響 SSR 標(biāo)記包括 PCR 和電泳檢測 。安全進(jìn)行 PCR 的前提是保證模板、使用物品的無污染和操作規(guī)范，針對(duì)不同作物的不同試驗(yàn)要求，建立相適應(yīng)的 PCR 反應(yīng)體系，又是取得試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。 PCR 反應(yīng)有幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：模板 DNA 的純度和數(shù)量；引物的質(zhì)量與特異性；酶的質(zhì)量與數(shù)量； Buffer（ Mg2+）數(shù)量； PCR 循環(huán)條件 [9]。因此在進(jìn)行抗性鑒定實(shí)驗(yàn)過程中一定要特別注意這些步驟的操作。 而且實(shí)驗(yàn)材料的選擇是在株系群體中選擇的，應(yīng)避免試驗(yàn)材料間 DNA 的交叉污染或外來 DNA 的污染。使用冷凍干燥葉片法，可以將每個(gè)樣品在單獨(dú)的離心管中研磨，研磨使用的小鋼珠最好是一 次性的，如果是反復(fù)使用小鋼球，必須徹底清洗干凈。使用液氮和研缽研磨葉片組織時(shí)，必須在每次研磨前徹底清理干凈研缽和研磨棒 [10]。以及在使用液氮研磨時(shí)，要先將研缽用液氮冷卻，在加入液氮后，要先將葉片壓碎，研磨時(shí)要快速用力，盡量使用樣品磨成粉末狀。 其他因素的影響 通過田間人工接蟲、田間調(diào)查和室內(nèi)生化分析研究了不同高粱材料對(duì)蚜蟲的抗性及其與次生代謝物的關(guān)系。結(jié)果顯示，高粱抗蚜蟲性狀屬單基因顯性簡單遺傳，通過回交轉(zhuǎn)育方式容易獲得抗性基因。高粱抗蚜蟲性狀與植株體內(nèi)多酚氧化酶活性及丁布（ DIMBOA）含量間的關(guān) 系表現(xiàn)出年度間的差異，有時(shí)抗性與感性材料間的多酚氧化酶活性和丁布含量都不表現(xiàn)質(zhì)的不同，說明另有更重要的次生代謝物實(shí)際控制著高粱的抗蚜性狀 [11]。 另外由于時(shí)間原因，所分析的引物較少，以及實(shí)驗(yàn)材料播種時(shí)，品種混雜等因 素，也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。 4 結(jié)論 （ 1）高粱抗蚜性狀的表達(dá)主要是遺傳基因的影響，具有抗蚜性基因的植株在田間調(diào)查具有明顯比不抗蚜的植株受危害?。ㄒ妶D 2）。 （ 2）在對(duì)高粱重組自交系群體的 6 對(duì)引物分析以及通過田間表型觀察結(jié)果作