【文章內容簡介】 [4]。 各種年齡的牛都可感染牛病毒性腹瀉，以幼齡牛易感性最高， 在垂直傳播后 ， 會產生病毒血癥。 以含 BVDV 的血清作為原料時，就會污染制備的生物制品 [5]。豬瘟細胞苗生產過程中會使用到牛睪丸細胞以及牛血清 [6]；藍耳病疫苗（尤其是 弱 毒 疫 苗）生產工藝中在傳代細胞培養(yǎng)中會使用到牛血清，如果血清材料含有 BVDV 病原或抗體，會使豬瘟細胞苗和藍耳病疫苗污染。疫苗被 BVDV 污染后，會對其免疫效果產生干擾。 BVDV 抑制疫苗抗體的產生，同時刺激機體產生大量針對BVDV 的抗體，導致疫苗免疫失敗，表現為被接種動物體內存在較高水平抗體卻依然會爆發(fā)傳染病，其多數為 BVDV 抗體 [7]。此外，豬在接種了受污染的疫苗后也可能感染 BVDV，產生類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化 ， 王新平等 [8]從疑似豬瘟病料中檢出了 BVDV。近年，我國發(fā)現豬場出現不明原因的豬瘟和藍耳病免疫失敗現象，可能原因是疫苗受 BVDV 污染，導致免疫失效，母豬感染后還會出現交配困難、不孕、流產等現象 [9]。若不能及時監(jiān)測出疫苗中 BVDV 污染情況，會造成重大經濟損失甚至傳染病的流行。因此，對豬瘟和藍耳病疫苗受 2 BVDV污染情況的監(jiān)測與分析十分有必要。 目前 ， 可用 于 檢測疫苗中 BVDV 病原的方法主要有：牛腎細胞直接病變、免疫熒光技術（ indirect immunofluorescence, IFA）、酶聯免疫吸附試驗（ enzymelinked immunoadsorbent assay, ELISA）、病毒中和試驗（ Virus neutralization test, VNT）、瓊脂擴散試驗、 RTPCR 等 [10]。 BVDV 與 CSFV 基因組核苷酸同源性可達 60%，氨基酸同源性可達 85%[11]，血清學上可出現交叉反應[12]。污染 BVDV 的 CSFV 疫苗免疫后，采用血清學方法無法準確區(qū)分血清抗體是由 BVDV 感染產生的還是由 CSFV 弱毒疫苗產生的。 近年，分子生物學技術廣泛應用于 BVDV 的病原診斷，具有敏感、特異、快速、靈活、操作簡便的特點，并可用于各種組織、全血等樣品檢測。因此，本文擬采用 RTPCR 方法對CSFV和 PRRS 弱毒疫苗污染 BVDV情況進行檢測與分析 ，對指導畜牧業(yè)生產中科學使用疫苗有重要的指導意義 。 1 材料與方法 試驗材料 試驗疫苗 由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心從全國各地豬場收集其使用的豬瘟 細胞苗和藍耳病 弱毒 疫苗，進行初檢，選取懷疑為陽性的疫苗作為本試驗用 樣品。 試驗試劑 RNA 提取試劑（如： Trizol、冷氯仿、異丙醇、 75%酒精、 DEPC 處理水等）、引物、感受態(tài)細胞、 AMP、 IPTG、 Xgal 等由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供，One Step SYBR PrimeScript RTPCR Kit（一步 RTPCR 試劑盒）、 ExTaq 酶（ MIX）、DNA Marker20 pGEMT easy Vector 購自 Promega 公司，膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司， Quick Ligation Kit、連接酶 Buffer 購自 New England Biolabs 公司，DURED 染料購自泛博生物化學有限公司。 試驗主要儀器設 Sigma 318 離心機購自 Sigma 公司、 BSC 1300IIB2 生物安全柜購自新華醫(yī)療器械股份有限公司、 LSP96G PCR 儀購自 Labserv 公司、 DYYi2 電泳儀購自北京六一儀器廠、 BioRad 凝膠成像儀購自 BioRad 公司、 BGgds VIEW可見紫外分析儀購自北京百晶生物技術有限公司、細胞溫箱購自上海?，攲嶒炘O備有限公司、 SDC6 恒溫槽購自寧波新芝生物科技公司、 HZQC 空氣浴振蕩器購自東 3 聯電子技術開發(fā)有限公司。 試驗方法 RNA的提取 (1) 取疫苗 250 uL加入無 RNA 酶的 EP 管中，加入 750 uL Trizol 混勻，后室溫放置 5 min， 間或震蕩。 (2) 加入 20℃ 保存的冷氯仿 250 uL 劇烈震蕩混勻后置于 4℃ 冰箱 10 min。 (3) 置于離心機中以 12020 r/min， 4℃ 離心 15 min。 (4) 取 500 uL 上清（寧可少也不要取到沉淀物）于 EP 管中，加等量（ 500 uL）異丙醇，輕輕顛倒混勻，于 80℃ 冰柜沉淀 30 min。 (5) 將液體以 12020 r/min， 4℃ 離心 10 min。 (6) 棄去異丙醇，加入 75%酒精 1000 uL， 混勻，于 4℃ 冰箱靜置 5 min。 (7) 將液體以 12020 r/min， 4℃ 離心 5 min。 (8) 棄去酒精，晾干后用 30 uL DEPC 處理水溶解，于 20℃ 冰柜保存。 RTPCR檢測 BVDV NCBI 網站 GenBank 給出 6 對供參考的 BVDV 擴增引物序列，經過試驗研究，套式引物效果最好 [14]因此本試驗選用套式引物，對 NS5B 基因序列進行擴增，其中的引物為 P P P P4。 P1： 1048510583 5’ATCTTTCACACATAGCCCAAC3’ P2： 1124411264 5’GAAGCCATCATCCCCACGACG3’ 提取出來的 RNA 用 P P2 引物于 PCR 儀中進行一步 RTPCR，反應體系如表 1。 表 1 RTPCR的反應體系 試劑 用量 (uL) Primescript RT Enzyme MIX 2X One Step SYBR RTPCR Buffer F(P1) R(P2) ddH2O RNA 反應程序為 50℃ 反應 30 min， 94℃ 反應 2 min， 94℃ 變性 30 s， 55℃ 退火 30 s， 72℃ 延伸 1 min， 此三步為 30 個循環(huán)，后 72℃ 反應 10 min，最后 4℃ 保存。 4 巢式 PCR擴增 P3： 1047710498 5’TGGAGATCTTTCACACAATAGC3’ P4： 1081510836 5’GCTGTTTCACCCAGTTATACAT3’ 用 RTPCR 的產物為模板，利用引物 P P4 進行巢式 PCR 擴增，反應體系如表 2。 表 2 巢式 PCR擴增 試劑 用量（ uL） ExTaq 酶（ MIX） F(P3) R(P4) ddH2O DNA 反應程序為 94℃ 反應 3 min， 94℃ 變性 30 s， 55℃ 退火 30 s， 72℃ 延伸 1 min， 此 3 步為 33 個循環(huán)，后 72℃ 反應 10 min，最后 4℃ 保存。 瓊脂糖凝膠電泳 (1) 在管中加好瓊脂糖至標度。 (2) 將固體瓊脂糖加至錐形瓶，加緩沖液（ 1:100）。 (3) 在瓶口套上一次性手套在微波爐中加熱 3 min。 (4) 取電泳板并在上面加上玻璃板，再插上梳子。 (5) 取出錐形瓶加染色劑 5 uL（染色劑不穩(wěn)定，加熱之后再加防止分解） 。 (6) 將瓊脂倒入玻璃板上至半個梳子高度（不要倒出氣泡），靜置 1520 min。 (7) 加 DNAmarker 2020 5 uL 加入第一個或中間的孔。 (8) 將擴增產物取 5 uL 加入平板孔中。 (9) 將玻璃平板取出放入電泳池，對齊放平，蓋好蓋，調至 130 V， 130 mA啟動，電泳 30 min。 (10) 將膠取出孔朝上放入凝膠成像儀中，先開白光調整位置，后打開紫外光先自動曝光，等到一個合適的亮度后手動曝光，保存。 膠回收提純 將凝膠成像儀中呈現較亮的 360 bp 左右的片段的 PCR 未純化產物送上海生工公司測序，有 3 個 樣品 測序失敗，需進行 目的 DNA 的 克隆 轉化 。 (1) 進行電泳后在凝膠成像儀中找到目的片段。 (2) 在切割儀中墊上一個一次性手套，放上凝膠，打開紫外燈，盡可能小的 5 切下目的條帶并分裝到 EP 管中，并在天平中進行稱重。 (3) 使用 QIAGEN 公司的膠回收試劑盒，按重量的 3 倍體積加入 Buffer QG。 (4) 將 EP 管裝在漂浮板上在水浴溫箱中 50℃ 水浴加熱 10 min左右，直至凝膠完全溶解。 (5) 將液體移入渦旋管中， 12020 r/min， 22℃ 離心 1 min， 棄掉濾液。 (6) 加入 750 uL Buffer PE 洗液 12020 r/min， 22℃ 離心 1 min， 棄掉濾液。 (7) 開著蓋 12020 r/min， 22℃ 離心 1min， 換一個 EP 管。 (8) 加 Buffer EB 洗脫液 40 uL， 室溫靜置