【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 五、 變性、復(fù)性及雜交 變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。 變性 （ 1）、 變性： 核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價(jià)鍵的斷裂稱核酸的降解。 DNA 的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。 P350 圖 518 變性過(guò)程 熱變性 因素 酸堿變性（ pH 小于 4 或大于 11，堿基間氫鍵全部斷裂） 變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 260nm 吸收值升高。 變性后 粘度降低，浮力密度升高。 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。 （ 2）、 熔解溫度（ Tm）或稱熔點(diǎn)： DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。 DNA 的 Tm 一般在 70— 85℃之間。 濃度 50ug/mL 時(shí)，雙鏈 DNA A260=，完全變性（單鏈） A260= 當(dāng) A260增加到最大增大值一半時(shí)，即 時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為 Tm。 （ 3）、 影響 DNA的 Tm 值的因素 ① DNA 均一性 均一性高，熔解過(guò)程發(fā)生在很小的溫度范圍 內(nèi)。 ② GC 含量與 Tm 值成正比， GC 含量高，則 Tm 越高，測(cè)定 Tm，可推知 GC 含量。 GC%=（ ） P351 圖 519 圖 520 Tm 值與 GC 含量的關(guān)系 ③介質(zhì)中離子強(qiáng)度 其它條件不變，離子強(qiáng)度高， Tm 高。 P351 圖 521 復(fù)性 變性 DNA 在適當(dāng)（一般低于 Tm20— 25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 變性 DNA 在緩慢冷 卻時(shí)（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。 DNA 片段越大，復(fù)性越慢； DNA 濃度越大，復(fù)性越快。 復(fù)性速度可用 Co t衡量。 Co 為變性 DNA 原始濃度 mol L1， t為時(shí)間，以秒表示。 P352 圖 522，不同 DNA 的復(fù)性時(shí)間。 A． 1 個(gè)核苷酸對(duì)（ ） 圖上查出 Cot1/2=4 若濃度為 Co= mol/L 則復(fù)性 50%所需時(shí)間 t= 秒 若要全部復(fù)性， Cot=104 t= 秒 B． 106堿基對(duì) 圖上查出 Cot1/2=10 若濃度 Co= umol/L則復(fù)性 50%所需時(shí)間 t=107秒，約 115 天。復(fù)性 100%Cot=500 t=5 108秒， 5758 天。 對(duì)于 ， 106bp，濃度達(dá)到 umol/L級(jí)時(shí)，濃度已很高。 復(fù)性機(jī)制： 1020bp 成、拉鏈 雜交（ DNA— DNA、 DNA— RNA） 將不同來(lái)源的 DNA 混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源 DNA 之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)會(huì)形成雜交分子。 第五節(jié) 核酸研究技術(shù) 一、 核酸的分離純化 要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。 條件溫和，防止過(guò)酸、過(guò)堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。 DNA 分離純化 真核 DNA 以核蛋白（ DNP）形式存在， DNP 溶于水或鹽（ 1mol/L），但不溶于 ，利用此性質(zhì)，可將 DNP 與 RNA 核蛋白分開(kāi)，提取出 DNP。 DNA 核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 RNA 的制備（重點(diǎn)介紹 mRNA 的分離、純化） 用 ，上清中即為 RNA 核蛋白（ RNP）。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等 必須防止 RNA 酶對(duì) RNA 的破壞。 二、 核酸的凝膠電泳 瓊脂糖電泳 ① 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比 ② 凝膠濃度 ③ DNA 的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 ④ 電流，不大于 5V/cm PAGE 電泳 三、 限制性核酸內(nèi)切酶（ 1979年發(fā)現(xiàn)） 限制修飾系統(tǒng) 圖 II 型核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶有 I、 II、 III 三種類型，其中 II 型酶在 DNA 克隆中十分有用。 II 型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子 Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反向重復(fù)）。 II 型酶的切割頻率 識(shí)別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 Not I GCGGCCGC 限制酶的命名： 第一位： 屬名 E（大寫） 第二、三位： 種名的頭兩個(gè)字母小寫 co 第四位： 菌株 R 第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類酶的編號(hào)。 同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 BamH： GGATCC 同裂酶 BstI 識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。 BamHI： GGATCC 同裂酶： BstI GGATCC 同尾酶： BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC 星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性 pH，或 50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。 例如 HindIII AAGCTT 四、 DNA物理圖譜及構(gòu)建 （限制酶切圖譜、 DNA 酶切位點(diǎn)圖譜） 在研究某一種 DNA 時(shí)，弄清該 DNA 分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此 DNA 的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建 DNA 物理圖譜： （ 1）單酶完全降解和部分降解 （ 2）雙酶降解 圖 五、 分子雜交 Southern Blotting P353 圖 523 DNA 樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影 變性（ NaOH ） 轉(zhuǎn)膜（ NC 膜） 固定（ 80℃， 46h） 雜交（高鹽濃度， 68℃，幾小時(shí)） Southern Blotting 可用于 DNA 之間同源性分析，確定特異性 DNA 序列的大小和定位。 可用 DNA 或 RNA 探針。 Northern Blotting 研究對(duì)象是 mRNA 檢測(cè)可與探針 DNA 同源雜交的 mRNA 分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定 mRNA 的產(chǎn)生，即特定基因的表達(dá)。 mRNA 易形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，總 RNA 或 mRNA 需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止RNA 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 Western Blotting 是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。 六、 DNA序列分析 （一） 化學(xué)裂解法（ MaxamGilbert 法） DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸 DNA 片段的 PAGE 上分離。 一定濃度的特測(cè)片段 32PGCTACGTA 特異性化學(xué)裂解 在 A 處 ： 32PGCT 和 32PGCTACGT 在 G 處： 32pGCTA 在 C 處： 32PG 和 32PGCTA 在 T 處： 32PGC 和 32PGCTACG 圖 硫酸二甲酯特異切割： G 甲酸特異切割： G 和 A 肼在 Nacl 條件下切割： C 肼在無(wú) Nacl 條件下切割： T 和 C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼（有 Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（無(wú) Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 從下往上讀： CTACGTA 末端 G 不能讀出。 （二） 雙脫氧終止法 英國(guó) Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu) 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1980 設(shè)計(jì)出 DNA 測(cè)序法 1980 再獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 合成一段與待測(cè) DNA 序 列互補(bǔ)的 DNA 片段群。 圖 胰島素的基因工程： A 鏈 63 個(gè)核苷酸 B 鏈 90 個(gè)核苷酸 （三） 序列分析儀 四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的 ddNTP 七、 DNA合成（合成探針、引物、基因） 化學(xué)合成 —— DNA合成儀 DNA 固相合成（亞磷酸三酯法） 合成方向： 3’ 5’端 5’OH 用二對(duì)甲氧三苯甲基（ DMT）保護(hù)， 堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 3’OH 用氨基磷酸化合物活化 P353 合成過(guò)程 保護(hù)： 5’OH、活化 3’OH、 保護(hù)所有 NH2 DNA 的酶合成 —— PCR 用 DNA 聚合酶 I 必備條件： ①模板 DNA（單鏈） ②引物 ③ DNA 聚合酶 ④ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ⑤一定濃度的 Mg2+ 鏈合成方向： 5 ’ 3’端 新的 DNA 鏈合成，從引物 DNA 的 3’OH 開(kāi)始。 圖 鏈的增長(zhǎng)反應(yīng)是引物 DNA 的 3’OH，對(duì)脫氧核糖核苷三磷酸的α 磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果。 化學(xué)合成：方向 3’ 5’，不需 DNA 模板，不用酶。 生物合成：方向 5’ 3’，需模板，引物，用酶。 計(jì)劃： 6 第七章 激 素