【正文】 的細胞層。 類型： 正常細胞培養(yǎng) 腫瘤細胞培養(yǎng) 第二頁，共七十頁?？寺⌒纬珊箫暭毎麧u死亡，換液時去除。 (三 ) 肝細胞培養(yǎng) ?肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點，能獲得典型上皮細胞培養(yǎng)。 第二十二頁，共七十頁。 第三十頁，共七十頁。 1．培養(yǎng)技術要點： ?[來源和取材 ] 巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 生長特點：細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng) 50 ~ 52 小時后將出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。 ?神經(jīng)膠質(zhì)細胞為較易培養(yǎng)成分，它分少突、星形和小膠質(zhì)三種 。 ?腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。 第五十九頁，共七十頁。 第六十四頁，共七十頁。正常細胞，在體外培養(yǎng)時都不易生長，建立細胞系更難。 Hela細胞 第六十七頁，共七十頁。 第六十三頁，共七十頁。 第五十八頁，共七十頁。 第五十四頁，共七十頁。 第四十六頁，共七十頁。取材常用生后 1 ~ 2 天的乳鼠 (Wistar 大鼠更好 )。 ? 巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。毛細血管小段一般成自 1 ~ 4 個內(nèi)皮細胞， 以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細胞島，能持續(xù) 2 ~ 5 天。 1. (1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于 4℃ 中，但不宜超過 12 小時； 無菌剪取長 10 ~ 15 厘米一段 。 (5) 接種：末次離心后參加含有 1％ ~ 2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實驗目的而定。 第六頁，共七十頁。 第一節(jié) 正常細胞培養(yǎng) ?正常細胞，在體外培養(yǎng)時都 不易生長，建立細胞系更難。 第七頁，共七十頁。 1．初代組織塊培養(yǎng)： ?肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。 ?人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細胞生長后，一般傳 6 ~ 7 代后即衰退，難以長期維持。 第三十一頁，共七十頁。 ?實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。數(shù)日后融合停止，此時能觀察到橫紋。 神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元有共存關系。 第五十六頁，共七十頁。 成纖維細胞排除法 1．機械刮除法： 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭 (用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲 )，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用 (也可用特制電熱燒灼器刮除 )。 5．其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重 ~ 的密度梯度離心液，參加細胞懸液后，在 23℃ 中 800g 離心 10 分鐘。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成 1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。 第六十六頁，共七十頁。用此法處理后， 成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落 ，經(jīng)過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。 ? 培養(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養(yǎng)更易成功。 (3)濾過、計數(shù)、接種：向末次沉降物中參加適量營養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)或紗布濾過，計數(shù)細胞并調(diào)整好細胞密度，接種入培養(yǎng)瓶或皿中，置 5％ C02 溫箱中培養(yǎng)； (4)傳代：細胞生長集合后，可用 ％胰蛋白酶消化法做傳代處理。 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 第四十五頁，共七十頁。 (一 ) 骨骼肌細胞培養(yǎng) ? 動物胚或幼體的 大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料 。 (二 ) 巨噬細胞培養(yǎng) ? 巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。 (5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次； (6) 制細胞懸液：末次沉淀物仍用含 10％小牛血清的 Dulbecco 改進 Eag1e 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打； (7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中， 37℃ 培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭 1 ~ 3 小時中，毛細血管小段和內(nèi)皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養(yǎng)液中漂??； (8)換液：吸除培養(yǎng)液，再參加腫瘤條件培養(yǎng)液；每兩天換液一次。 第十九頁，共七十頁。 ? 培養(yǎng)程序： ? (1) 取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區(qū)粘膜少許； ? (2) 清洗：用含慶大霉素 (400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1 的 Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成 1mm大??； ? (3) 消化：在 I 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于 37℃ 中消化 80 分鐘； ? (4) 離心：收集細胞懸液， 800 轉 /別離心后， Hanks 液漂洗兩次； 第十三頁，共七十頁。 ? 向培養(yǎng)基中加氫化可的松 (10 μg/m1)、 106M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和 10 ng/m1 促表皮生長因子 (EGF) 能促表皮細胞生長。 ?正常細胞難培養(yǎng)的 原因是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格 . ?但只要一切條件適當仍有培養(yǎng)成功