【正文】 物的分析 ? 八、 Molecular marker ? 九、 PCR技術(shù)的應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)體系 ? 基本技術(shù) ?基因及產(chǎn)物 分子檢測技術(shù) ?基因及產(chǎn)物 獲取技術(shù) ?基因 功能研究技術(shù) 基本技術(shù) 1. 瓊脂糖凝膠電泳 2. SDSPAGE 電泳 3. PCR技術(shù) 4. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR(Polymerase Chain Reaction) 一、歷史及其發(fā)展： ? 1971年 ， Khorana提出：經(jīng)過 DNA變性 ，與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。濃度過低又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。 ? PCR產(chǎn)物電泳 EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。 ?它將 RAPD隨機性和專一性擴增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達(dá)選擇的目的。 ? 酶切分析 根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) 延伸溫度和時間 ?溫度 ： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ ，高于 90℃ 時， DNA合成幾乎不能進行 ?Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性 ： 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 ?時間 ：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。 ? Mg2+ ： for Taq polymerase activity Mg2+對 PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為 200umol/L時， Mg2+濃度為 ～ 。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。不用時應(yīng) 20℃ 保存。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的 DNA擴增檢測?？烧页雠c靶基因連鎖的 RAPD標(biāo)記，進行基因定位。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測 PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀。 ?延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。 ? Taq DNA polymerase（ Taq DNA 聚合酶）： 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。首先待擴增 DNA 模板加熱 變性 解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生 退火 ，再將溫度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 10．解鏈溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] Tm = +*(GC%)600/L [ 20nt] Tm一般５５ ℃ ～８０ ℃ ［５５ ℃ ～５８ ℃ 最佳］ PCR反應(yīng)中結(jié)合溫度（ anneaning temperature） T = Tm 5℃ ?P+、 P的設(shè)計方法 四、 PC