【正文】 022 裂 葉 狀波 浪 狀圓 鋸 齒 狀細(xì) 圓 鋸 齒 狀齒 形鋸 齒 狀四、微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 生理生化 碳源和氮源 運(yùn)動(dòng)性 細(xì)胞壁組成 滲透耐性 能源 氧關(guān)系 發(fā)酵產(chǎn)物 最適 pH和生長范圍 一般營養(yǎng)類型 光合作用色素 最適生長溫度和范圍 鹽需求及耐性 發(fā)光 次級代謝產(chǎn)物形成 能量轉(zhuǎn)換機(jī)制 對代謝抑制劑和抗生素的敏感性 貯藏內(nèi)含物 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 生理生化 Division based on membrane position: a) gramnegative – have outer and inner membranes and a thin cell wall (Escherichia coli) b) grampositive – have no outer membrane, but have a thicker cell wall (Bacillus subtilis) c) neither gram nor gram+ no cell walls (mycoplasm) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 生理生化 ? API (bioMerieux)(biochemical) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 生理生化 ? BBL Crystal (Becton Dickinson) ? 將傳統(tǒng)的生化反應(yīng)、酶 —底物呈色反應(yīng)與熒光增強(qiáng)顯色技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)鑒定反應(yīng)最佳組合。 ? 單細(xì)胞分離法對 操作技術(shù) 有比較高的要求。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物接種和培養(yǎng) ? 穿刺接種 ? 用接種針調(diào)取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)（不要刺到底部），再沿原路拔出； ? 此法用于厭氣性細(xì)菌接種，檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。 ? 獲得純培養(yǎng)物 對微生物學(xué)研究至關(guān)重要。 ? 中國藍(lán)平板或伊紅美藍(lán)平板： 可抑制 G+細(xì)菌，有選擇地促進(jìn)G菌生長，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。 REP PCR 擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù) DNA 片段來獲得菌株特異性遺傳圖譜 , 其中重復(fù) DN A 片段包含了一個(gè)高度保守的回文序列 (REP)為 38 bp 的片段 , 由 1個(gè)保守回文段以及兩端分別有 6 個(gè)降解位點(diǎn)和 1 個(gè) 5 bp 的可變框構(gòu)成。 dNTP (每種 mmol/L) 8 μL。 B: 分生孢子梗形態(tài) ( 100)。 CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在 %以下 。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 安瓿管的準(zhǔn)備 ? 清洗 ? 選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管； ? 2%鹽酸浸泡 8～ 10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗 2～ 3次； ? 置于烘箱中烘干 。 ? 保藏 將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮?dú)庀?(150℃ )或液相 (196℃ )。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結(jié)法 ? 將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－ 80℃ 冰箱中凍結(jié)保存的一種長期菌種保藏方法。 ?液面高出斜面頂部 1cm ?4～ 6 ℃ ，干燥處； ?直立放置； ?保藏時(shí)間 1 ～ 2年。 2:β tubulin gene PCR amplification result. 表 ITS序列特殊位點(diǎn)堿基差異 Table Difference of base position in ITS sequence 堿基位點(diǎn) Base position 140 166 172 173 Aspergillus brasiliensis IMI 381727 C C T C Aspergillus niger ATCC 16888 A T A A CMCC(F)98003 A T A A 注 : 以 18S和 ITS1區(qū)之間的 TTACCG序列中的第一個(gè) ―C‖為 1位點(diǎn) . Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1. 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 以 18S和 ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個(gè) “C”為 1位點(diǎn) 。 C保存 。 ?各類 標(biāo)準(zhǔn)中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株 (CMCC(F) 98003) ,需要重新復(fù)核鑒定 。 用無菌接種針挑取少量培養(yǎng)物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團(tuán)分散開，蓋上蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、?；⑵抗?、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子頭、分生孢子等 。 ? 個(gè)體相對較小的微生物 ，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng) 。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 液體接種 ? 操作方法與斜面接種基本一致，只是將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)使接種環(huán)與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散； ? 塞上棉塞，輕輕搖動(dòng)均勻； ? 如果菌種培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，使用移液管或滴管接種。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ?涂布平板法 ?平板劃線法 ?平板傾注法 ?稀釋搖管法 ?液體培養(yǎng)基分離法 ?單細(xì)胞（孢子）分離法 ?選擇培養(yǎng)基分離法 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 少量樣品加到平板中央（ ）； 玻璃三角涂棒浸入酒精； 沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻； 無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當(dāng)條件下培養(yǎng)。 ? 麥康凱平板： 具中等強(qiáng)度選擇性，抑菌力略強(qiáng)，有較少革蘭陰性菌不生長。 PCRSSCP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與單鏈 DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合 ， 利用不同構(gòu)象單鏈 DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動(dòng)速率的差異 , 檢測出 DNA短片段中存在的單核苷酸突變 ,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因多態(tài)性的研究 。 引物 (10 μL/L)各 μL。 C: 分生孢子形態(tài) ( 400). Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100)。 ? 結(jié)合形態(tài)學(xué)、碳源利用情況和 ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果 , 將 CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉 （ Aspergillus niger ）。 ? 棉塞 ? 打棉塞， 160℃ 定型 2h； ? 標(biāo)簽 ? 激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號和保藏日期，大小約 10 20mm。 同“－ 80℃ 冰箱凍結(jié)法” 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 保藏時(shí)間長； ? 保藏效果好，菌種不易退化； ? 對設(shè)備要求高 (程控降溫儀、液氮罐 )，對人員操作水平要求高； ? 保藏成本高。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 保藏、運(yùn)輸方便； ? 保藏時(shí)間長 (5 ～ 10年 )； ? 對設(shè)備要求高 (真空冷凍干燥機(jī)、多歧管 )，對人員操作水平要求高； ? 冷凍干燥過程對菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 操作步驟： 液體石蠟預(yù)處理 斜面培養(yǎng)物制備 灌 注 石 蠟 保 藏 ?優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟 ?滅菌： — 121℃ 濕熱滅菌 30min，蒸發(fā)水分； — 160 ℃ 干熱滅菌 2h； ?冷卻至室溫。1: ITS rDNA PCR amplification result 。 C 10 min, 4176。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ?各種標(biāo)準(zhǔn)中仍將繼續(xù)采用 ATCC 16404作為質(zhì)控菌株 。 培養(yǎng)物 劃線接種于葡萄糖 酵母提取物 蛋白胨固體培養(yǎng)基上， 25℃ 培養(yǎng) 2～ 3 d后 ，取酵母菌制作