【正文】 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－ 196℃的液氮或－ 150℃ 左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。 ? 菌種易退化、污染。 CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性 也具有很高的相似性 , 序列同源性均在 %?100%之間 。 C培養(yǎng) 7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài) Fig Macromorphology and micromorphology on 25176。 C培養(yǎng) 7 d ? Biolog鑒定 ? 生長(zhǎng)濁度試驗(yàn) ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 ? ITS4: 5?TCCTCCGCTTATTGATATGC3? ? ITS5: 5?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3? ? β微管蛋白基因序列 分析 ? Bt2a: 5?GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC3? ? Bt2b: 5?ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC3? 反應(yīng)體系： 100 μL, 10 擴(kuò)增緩沖液 10 μL。 ? 六類(lèi)鑒定試驗(yàn)板，可鑒定 500種細(xì)菌 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 化學(xué)成分分析 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 呼吸醌 （甲基萘醌和泛醌） ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 極性脂 ? 細(xì)胞質(zhì)膜： 脂肪酸 除放線菌外的細(xì)菌 ? 外膜： 分枝菌酸 ? 細(xì)胞壁： 肽聚糖 （氨基酸和糖） ? 全細(xì)胞： 糖和蛋白質(zhì) 放線菌 m i n2 . 5 5 7 . 5 10 1 2 . 5 15 1 7 . 5 20pA131415161718 F I D 1 A , ( E 1 2 6 1 9 . 6 0 2 \ A 0 0 4 1 0 8 0 . D ) 1.748 2.032 2.110 3.638 4.066 7.066 8.578 8.720 10.226 10.851 11.529 11.696 11.952 12.116醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 ? G+Cmol% ? 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, rDNA ITS region, ? βtubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes. ? DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) ? DNADNA hybridization ? RAPD, RFLP, AFLP, SSCP, EricPCR, BOXPCR, RepPCR , LAMP. 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 基因型分析 DNA 指紋圖譜分析 1 2 3 4 EricPCR BOXPCR RepPCR SSCP ERIC－ PCR 以細(xì)菌 DNA中串聯(lián)重復(fù)序列為引物， 通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，在不同種屬個(gè)體間表現(xiàn)為在染色體上存在的位置和拷貝數(shù)不同，以電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，應(yīng)用于菌株分型。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 選擇培養(yǎng)基特性 ?促生長(zhǎng)能力 ?抑制能力 ?指示（鑒別）能力 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 傳統(tǒng) 選擇性培養(yǎng)基 ? 血平板： 適于各類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，一般細(xì)菌檢驗(yàn)標(biāo)本的分離，都應(yīng)接種此平板。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 平板接種 ? 平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計(jì)數(shù)等； ? 平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面； ? 斜面接平板：點(diǎn)種法、劃線法。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物分離 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ? 純培養(yǎng)物 是指來(lái)源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群體。 ? 營(yíng)養(yǎng)肉湯： 用于標(biāo)本及各類(lèi)細(xì)菌的增菌 ? 巧克力血平板： 其中含有 V和 X因子，適于接種疑有 嗜血桿菌、奈瑟菌 等的標(biāo)本。 BOXPCR 根據(jù) BOX插入因子 (大小為 154 bp, 由保守性不同的 box A(57 bp) 、 box B(43 bp) 和 boxC(50 bp)等亞單位組成 )設(shè)計(jì)引物 , 擴(kuò)增微生物基因組 DNA 的重復(fù)性片段 , 最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性 。 DNA模板 1 μL 。 C, 7 d 注 : A菌落形態(tài) 。 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ?β微管蛋白基因序列 分析 圖 基于 β微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig Neighbourjoining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri 注 : 圖中發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)只顯示 Bootstrap 值大于 50%數(shù)值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, geic distance. CMCC(F)98003與黑曲霉 A. niger 序列同源性為 100%。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 操作步驟 ? 冷凍管準(zhǔn)備 ? 保護(hù)劑制備 ? 保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備 ? 預(yù)凍 — 將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到 4℃ ，將制備好的冷凍管放入其中，以 1℃ /min降溫速率降至 35℃ ； — 使用程序降溫盒。 準(zhǔn)備冷凍管 準(zhǔn)備保護(hù)劑 （ 10%15%甘油） 準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液） 制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管） 保藏（ 80℃ ， 2～ 5年） 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 Microbank 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結(jié)法 ? 使用方便； ? 保藏時(shí)間較長(zhǎng)； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (80℃ 冰箱 )； ? 運(yùn)輸不方便。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體石蠟法 ? 操作簡(jiǎn)單，使用比較方便； ? 對(duì)設(shè)備要求不高，對(duì)人員操作水平有一定要求； 140 166 17 173 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? ITS rDNA區(qū)序列 分析 圖 基于 ITS區(qū) rDNA序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences 注 : 圖中發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)只顯示 Bootstrap值大于 50%數(shù)值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, geic distance. CMCC(F)98003與與 A. niger ATCC 16888聚類(lèi)在分類(lèi)距離最近的一個(gè)分支上 , 序列相似性達(dá) 100% 。 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 形態(tài)學(xué)鑒定 圖 25176。 巴西曲霉 (Aspergillus brasiliensis） 黑曲霉 (Aspergillus niger) 黑曲霉 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 形態(tài)學(xué)鑒定 ? CYA培養(yǎng)基 , 25176。 醫(yī)療器械無(wú)菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2