【正文】 幾種試劑，重點(diǎn)掌握酶免疫法的基本概念。關(guān)鍵是兩個蛋白間的接頭序列 linker， 一般說來3~5個氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。（ 3）單鏈抗體（ single chain antibody SCA 或 single chain FV,SCFV）， 由 VH和 VL通過一段連接肽（ linker） 連接而成的重組蛋白。 第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體 的改進(jìn) ? 改造鼠源性單克隆抗體的目的：一是降低免疫原性；二是降低相對分子量，增加組織通透性。如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細(xì)胞生長的載體，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞密度可達(dá) 108細(xì)胞 /ml。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 1）雜交瘤細(xì)胞的鑒定 ? 正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為 40，全部是端著絲粒染色體。 ? 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。 ? （ 2）用于融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。 ? 多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化，甚至是極不純的混合物，如部分純化的干擾素。 ? 1975年： K246。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的 1/80~1/3，而且鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬功能（免疫調(diào)理）、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，只保留同抗原特異性結(jié)合的活性。顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔 107個細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔 1~3周，再追加免疫 1~2次，可溶性抗原則按每只小鼠 10~100?g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔 2~4周，再用不加佐劑的原抗原追加免疫 1~2次。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（ H）、 氨基喋呤（ A） 和胸腺嘧啶（ T） 配制的。 ? 一般融合后獲得的 雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過大約 3次的克隆化，才能達(dá)到 100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆。因為雜交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來自 BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用 BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。 IgG2b、 IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低?？贵w分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。（ 2） 配基 Ig嵌合型蛋白，如 IL2Ig。 三、基因工程抗體的表達(dá) ? 原核細(xì)胞表達(dá) ? 真核細(xì)胞表達(dá) ? 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) ? 轉(zhuǎn)基因動物表達(dá) 第五節(jié) 抗體診斷試劑 ? 一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 ? 鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備步驟：（ 1）制備細(xì)菌抗原， O（ 菌體）抗原， H（ 鞭毛）抗原；（ 2）免疫動物和制備抗體血清 ? 乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg） 的反向被動血凝診斷試劑 ? 妊娠診斷試劑 ? 抗 ABO血型系統(tǒng)血清 二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)方法難以觀察或檢測的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，用于對微量抗原物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測，結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測定。免疫標(biāo)記技術(shù)有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù) 二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 熒光抗體診斷試劑 ? 熒光色素如異硫氰酸熒光素（ FITC） 等標(biāo)記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。（ 40受體FV型融合蛋白。書中表 45給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用。 ? 續(xù)（ 2）離子交換法 ? 在最適離子強(qiáng)度及 pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化 25~100倍。動物體內(nèi)誘生法操作簡便，也比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株，缺點(diǎn)是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 ? 有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細(xì)胞。脾 脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。有人認(rèn)為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳。由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的 B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此稱為單克隆抗體。 ? 1937年： Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（ ?）球蛋白、乙種（ ? ）球蛋白和丙種（ ? ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。 單克隆抗體和 多克隆抗體的制備 抗原 脾 B淋巴細(xì)胞 融合 融合 淋巴細(xì)