iywaaa生物技術(shù)制藥--全文預(yù)覽
【正文】 ）體外培養(yǎng)法可獲得 10?g/ml的抗體；（ 2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得 5~20mg/ml的抗體。 ? 染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗體，而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低。用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化容易成功。 ? 有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)，特別是制備以檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí)，免疫熒光法更有意義，在篩選抗體的同時(shí)，還能對(duì)所識(shí)別的抗原進(jìn)行定位判定。 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 ? （ 1）篩選陽(yáng)性克?。? ? 因?yàn)楫a(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5%左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 6）飼養(yǎng)細(xì)胞： ? 由于在最適的條件下大約有 105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。脾 脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。為了提高融合率，在 PEG溶液中加入二甲基亞砜 (DMSO）， 以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 3）誘導(dǎo)劑 PEG的影響： PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 1）細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞（ 1 108）與骨髓瘤細(xì)胞（ 2 107 ~3 107）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（ PEG） 作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r(shí)間控制在 2min以?xún)?nèi)，然后用培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋。有人認(rèn)為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳。書(shū)中表 41是骨髓瘤細(xì)胞系一覽表，可以參考。 一、抗原與動(dòng)物免疫 ? （ 2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得 ? 因免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。 ? 化學(xué)合成抗原，如精制的地高辛。由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的 B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，因此稱(chēng)為單克隆抗體。 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 基因工程技術(shù)為解決這兩個(gè)問(wèn)題提供了可能。 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標(biāo)記 單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，進(jìn)行免疫鑒定。 ? 20世紀(jì) 60年代初期：抗原決定簇，精制單價(jià)血清。 ? 1937年： Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（ ?）球蛋白、乙種（ ? ）球蛋白和丙種（ ? ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。 ? 1984年：人 鼠嵌合抗體 ? 1984年至今：?jiǎn)慰寺】贵w的鼠源性及分子過(guò)大的問(wèn)題得以解決，可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑。但是要解決以下兩個(gè)問(wèn)題 ：（ 1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（ 2）完整的抗體分子分子量過(guò)大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。 第二節(jié) 單克隆抗體 ? 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而生產(chǎn)的。 單克隆抗體和 多克隆抗體的制備 抗原 脾 B淋巴細(xì)胞 融合 融合 淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 克隆 1 克隆 2 克隆 3 克隆 4 第二節(jié) 單克隆抗體 ? 一、抗原與動(dòng)物免疫 ? 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 ? 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? 五、單克隆抗體的大量制備 ? 六、單克隆抗體的純化 一、抗原與動(dòng)物免疫 ? （ 1）制備用于動(dòng)物免疫的適當(dāng)抗原。 ? 在制備惡性腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體時(shí)，情況較復(fù)雜，需用整個(gè)腫瘤細(xì)胞做為免疫原，經(jīng)過(guò)篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞上的表面標(biāo)志分子上的單克隆抗體。不同品系的小鼠與大鼠在對(duì)某類(lèi)抗原的免疫應(yīng)答上是不同的。一般在采集脾細(xì)胞前 3日由靜脈注射最后一次抗原，其目的是使對(duì)應(yīng)的 B淋巴細(xì)胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因?yàn)榧?xì)胞融合后增殖最好的細(xì)胞是迅速分裂的細(xì)胞。其基本方法是用 4~8周齡 BALB/c小鼠的脾臟制成單個(gè)細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá) ~5 ?g/ml， 在 5%CO37℃ 下培養(yǎng) 4~5天，再分離脾臟細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。特別是 SP2/0細(xì)胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。但相對(duì)分
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