【正文】 尋我們想要尋找序列中的特定片段(圖 )：圖 Find sequence 用來搜尋特定序列片段 　 在 Find what 的字段中輸入欲搜尋的片段，按下 Find Next 就可以進行搜尋。圖 選擇所要編輯的圖形 　 接著編輯的圖形就會出現(xiàn)在圖譜窗口：圖 選擇斑馬魚海大基因，所出現(xiàn)的圖形畫面 　 若要修改內(nèi)建的圖形顯示方式，可以點選 按鈕(圖 )，針對個人喜好 進行設(shè)定：圖 Graphics Display Setup，為修改圖形顯示的工具 　 按下 OK 就可已更改為欲設(shè)定的圖形(圖 )：圖 修改后的結(jié)果 　 關(guān)于圖形的大小和文字的更變，我們可以按住 Ctrl 后按下圖 調(diào)整圖形的大小及文字的變更 按鈕，接著就 可以調(diào)整圖形和文字(圖 )： 　 我們還可以更進一步進行完整的編輯， 按下 按鈕可以點選圖譜窗口中任 何的圖形或文字進行編輯(圖 )：圖 更進一步的對圖形進行編輯 　 點選圖形或文本塊后可以進行上下拖移和改變形狀的功能； 按下鼠標右鍵可 以更改格式，點選 Properties 后可選擇許多不同表示方法(圖 )： (圖 )。而 degenerate 的選項則可以調(diào)整退化程度，越往右邊拉則序列退化度會 越大，反轉(zhuǎn)譯出所產(chǎn)生的 DNA 序列也就越趨于復(fù)雜。圖 加入新的 Marker 檔案 　 如此一來就可以在電泳分析的功能中加入用戶自己的 Marker。要開啟 Oligo List 時，使用者只要點選 即可(圖 )： 圖 開啟 Oligo List，對引子進行編輯和分析 (圖 )。圖 進入 BLAST 的程序，出現(xiàn)兩個區(qū)塊，上方區(qū)塊輸入序列，下方區(qū)塊為顯示分析結(jié)果 序列的輸入很簡單，使用者只要把想要分析的序列復(fù)制貼上至此區(qū)塊就可以了(圖 )。由此圖形可以得知用戶的序列在 800bp 前后的區(qū)域有最佳的比對結(jié)果；分數(shù)最高分的 區(qū)塊座落在 600bp 到 800bp 的部分，可以推測此區(qū)域可能扮演了重要的功能性。把光標移到圖形上方按 下鼠標右鍵點選 Plot Setup：圖 設(shè)定圖形表示的方式 用戶就可以根據(jù)自己的喜好設(shè)定圖形的表示方式(圖 )： 　 圖形要進行輸出的時候，只要把光標移到圖形上方，按下鼠標右鍵選擇 Camera 就可以復(fù)制圖形到其他檔案中。圖 以每 100 個 nucleotide 換行做輸出 　 另外一種輸出的方式是使用打印功能(圖 )， 用戶可以按下鼠標右鍵選擇 Print Preview， 在打印預(yù)覽畫面中程序會詢問是否選擇顯示 Consensus Sequence， 確定后按下 OK：圖 使用打印的方式輸出 ：圖 在打印的選項中，選擇 Adobe PDF 輸出電子圖 在打印機的選項(圖 )選擇用 Adobe PDF 或者是其他形式， 按下確定就可以輸 出成電子圖文件，如此一來就可以一次將全部比對的結(jié)果輸出，并兼顧到畫面美觀。進行 Dot Matrix 功能時，用戶必須調(diào)整此兩數(shù)值到最佳狀態(tài)，才會 得到最佳的結(jié)果， 下列幾個圖形范例(圖 )， 是用不同的數(shù)值所表現(xiàn)出不同的分 析結(jié)果：圖 Stringency=1，Window=1 圖 Stringency=1，Window=10 ，Window=10 圖 Stringency=40，Window=1 ： 在 NTI 主程序中選取 Analyses→Primer design→Alignment PCR List 時會出現(xiàn)一個 Alignment PCR 窗口(圖 )于主程序下方：圖 使用 Alignment PCR List 比對 選擇 Add 或是 Load 把要比對的序列檔案加載(圖 )：圖 點選 Add 或 Load 載入比對的序列 (圖 )：圖 執(zhí)行比對，會開啟 AlignX 的窗口 接著進行序列比對(圖 )：圖 進行序列比對 在比對的序列部分選取好要 PCR 的范圍按下鼠標右鍵點選 Design PCR Primers (圖 )： ，進行 Primer 的設(shè)計 這時就會出現(xiàn) Primer 設(shè)計的頁面(圖 )：圖 設(shè)定 Primer 的結(jié)果 接下來就依照自己的需求設(shè)計 Primer，注意在 Amplicon Length Min 的項目不可以 設(shè)定比選取的范圍長。 　 序列串接　 使用Vector NTI中的ContigExpress程序()可利用序列相似度，將小片段序 列進行串連。 若要關(guān)掉訊號只要按下鼠標右鍵再點選 就可以將訊號關(guān)掉。 串接好的序列大部分會出現(xiàn)序號干擾的問題，此問題在于定序的訊號在定序開 始和結(jié)束的時候會特別不穩(wěn)定，這些不穩(wěn)定的部分大都會造成序列判斷的錯誤，用 戶首先需先了解訊號圖譜可以相信的部分，此部分的訊號峰值相當尖且單純；訊號 不穩(wěn)定的部分峰值平緩且有許多噪聲重迭： ，較為平緩的訊號較容易判斷錯誤 C C 2357 T G T T C C G A C C C T G C C G C T T A A C A G G A T A C C T G T C C G C C T Fr agment E1 2_T7 0 C C 999 T 1 001 G T T 1 003 C C G A C C C 1 005 1 007 1 009 1 1 01 T G 1 3 01 C C 1 5 01 G C T T A A C A G G A T A 1 7 01 1 9 01 1 021 1 023 1 025 1 027 C C T 1 029 1 031 G T 1 033 C C 1 035 G C C 1 037 T 1 039 以圖 為例訊號不穩(wěn)部分發(fā)生在定序開始跟結(jié)束的地方。 ，只要按下 OK 就會依使用者的需求展示比對 圖譜，圖 是把其中一個 block 命名為 JST，顏色改成黃綠色：圖 將其中一組 block 命名為 JST，并將顏色改成黃綠色 (圖 )：圖 以不同的顏色代表不同的 block 如果想要把蛋白質(zhì)序列中的 block 放在同一直列觀察，可以將特定的 block 點選后下按 或是從 Blocks→Link 將各序列的 block 放在同一列(圖 )：圖 將各序列的 block 放在同一列中觀察 。選好兩組序列后，程序會繪制出比對結(jié)果(圖 )：圖 兩個序列比對后的結(jié)果 比對結(jié)果(圖 )可以用鼠標左鍵拖曳放大直到看的清楚為止： ； 則是可以用來畫網(wǎng)格線進行比對(圖 )： 圖 增加網(wǎng)格線的比對結(jié)果 一開始使用 Dot Matrix Plot 比對出來的序列并不正確，使用者必須調(diào)整兩項參數(shù) ，可以按下 或是從上方 Matrix→Matrix Setup 做調(diào)整： 圖 Stringency 越小越嚴謹，Window 越大圖形越長 窗口(圖 )中有兩個項目會影響分析的結(jié)果，一個是 Stringency。只要將光標 移到排列的結(jié)果上方，按下鼠標右鍵選擇 Edit Alignment，或者從上方從程序上方選 View→Edit Alignment 進入：圖 手動排列比對 用戶只要利用鼠標反白標記想要移動的序列區(qū)段后， 就可以使用下方的綠色箭頭 按鈕進行前后移動(圖 )：圖 選取要編輯設(shè)定區(qū)塊 ，點選最下方的選項插入 Gap 進行調(diào)整(圖 )：圖 點選最下方的選項插入 Gap 進行調(diào)整 調(diào)整完畢后按下 OK 鍵或者是 Apply 鍵就完成重新排比，如下圖所示，圖 是調(diào)整前的結(jié)果，圖 則是調(diào)整后的結(jié)果：圖 調(diào)整前的結(jié)果 圖 調(diào)整后的結(jié)果 序列排列的前后順序可以手動移動， 將要移動的序列用鼠標點選拖曳就可進行移 動(圖 )：圖 選取序列利用拖曳方式進行移動 (圖 )，可以點選序列后按鼠標右鍵，選擇 第二個項目后按確定移除： 圖 選擇 Remove 移除序列 如果想要加入其他序列進行重新比對，可以將欲加入的序列反白，接著點選 或者從 Align→Add Selected To Alignment 將序列加入比對(圖 )：圖 選擇 Add Selected To Alignment 增加序列 想要將某一序列從程序中完全移除的話可以將序列反白后， 按鼠標右鍵選擇第二個項 目：圖 將序列從程序中完全移除，選擇 Delete ，可以先點鼠標右鍵后，選擇 Camera(圖 )：圖 利用 Camera 將序列輸出 在這個 Camera 選項中，F(xiàn)ormat 有兩種格式可以選擇，第一個是 Metafile，選擇此 格式序列會以圖形文件的形式輸出， 注意 Metafile 不會一次輸出全部的序列比對結(jié)果， 只會輸出屏幕中顯示的部分（有點像 Print Screen 的快照功能） ，想要將所有比對輸出 必須多次的使用 Metafile 輸出，圖 是使用兩次 Metafile 格式輸出的結(jié)果，第一次 輸出序列 1 到 109，第二次是 110 到 218：圖 使用兩次 Metafile 格式輸出的結(jié)果 ，用戶可以在 Range 的項目中選擇所有比對的結(jié)果，或 者是輸出特定的比對區(qū)域。右邊 的圖形則是表示序列比對的計算分數(shù)和分布范圍的關(guān)系。 把 BLAST 分析的項目點選打開后會出現(xiàn)類似主程序的畫面(圖 )：圖 直接打開之前 BLAST 分析的檔案，不需重新再次操作 BLAST ，分割成三個窗口，上面偏左的文件夾是文字敘述的窗口(圖 )，提供使 用者 BLAST 搜尋的設(shè)定條件和比對到的數(shù)據(jù)，用戶可以打開這些文件夾獲得更進一步的信息：圖 文字窗口，提供用戶設(shè)定條件與比對到的數(shù)據(jù) 用戶可以點選畫藍色底線的選項(圖 )，就會自動連上 NCBI 把相關(guān)的數(shù)據(jù)截取加載主程序中：圖 選擇藍色底線的部份，將直接連到 NCBI 下載相關(guān)數(shù)據(jù) (Basic Local Alignment Search Tool) 此時主程序的數(shù)據(jù)就是來自于 NCBI GeneBank 的數(shù)據(jù)(圖 )：圖 由 NCBI GenBank 下載得到的數(shù)據(jù) 用戶可以在比對到的結(jié)果上，按下鼠標右鍵后，選擇 Save Selected Hits 存入數(shù)據(jù)庫中(圖 )：圖 選擇 Save Selected Hits，將數(shù)據(jù)存入數(shù)據(jù)庫中 ，上方的序列是使用者的序列；下方的序 列是數(shù)據(jù)庫中比到的序列，注意在 BLAST 程序中只會顯示比對到的區(qū)域，不會顯示序列的全長。 Sequencing Primers：這項功能可以幫用戶設(shè)計定序時所需的引子，在窗口 (圖 )中設(shè)定想要設(shè)計的條件：圖 幫助使用者設(shè)計定序時所需之引子 設(shè)好條件之后只要按 OK 就會顯示引子數(shù)據(jù)，后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 利用 Sequencing Primers 分析的結(jié)果 Hybridization Probes：此功能適用于設(shè)計核酸探針(圖 )，能夠用在南方墨 點、北方墨點及定位雜交等實驗探針設(shè)計： ，可設(shè)計核酸探針 設(shè)定好條件后按下 OK 就會顯示探針數(shù)據(jù)， 后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 使用 Hybridization Probes，顯示探針數(shù)據(jù) NOTE：引子設(shè)計的條件和注意事項請參考相關(guān)的設(shè)定說明。以海大斑馬魚基因為例子，設(shè)計一個兩端帶有 EcoRI 和 NdeI 的限 制酶片段、Tm 值介于 55 到 60、GC 含量介于 50 到 60、長度介于 20 到 欲夾 的序列全長及引子數(shù)目，設(shè)定好相關(guān)條件后按下確定(圖 )： ”確定” 　 這時用戶在文字窗口(圖 )的下方字段可以看到多出一個 PCR Analysis 的文圖 文字窗口，增加了 PCR Analysis 的數(shù)據(jù) 件夾，上面會顯示用戶設(shè)計的引子數(shù)據(jù)： 　 在這個字段中使用者首先看到序列會被一個空格切成兩部分(圖 藍色部 分)，左邊的序列為使用者加入限制酶的序列；右邊的序列為設(shè)計的引子序列。設(shè)定好之后按 OK 就可以進入以下畫面： ，會得到左邊窗口的樣子 　 選 右邊的窗口是用戶的電泳膠片，左邊的窗口會有詳細的文字敘述。 Analyses→Translation→In Sequence Pane：這個項目其實就等于 按鈕，其 內(nèi)建的功能跟 Into New Protein 是一樣的， 差別只是在于轉(zhuǎn)譯的結(jié)果直接顯示在原 本的序列上方。 　 圖譜被程序標上限制酶的切位必須要移除。這些序列排列的設(shè) 定可以在 Display setup 的窗口內(nèi)點選 Save settings as 儲存，之后只要開啟主程序 就會依照我們的設(shè)定來排列(圖 )。 NOTE：上一章提到剪貼方式加載序列的方法和上面相同，只是要從主程序中左 上角的 File→Create New Sequence→Using Sequence Editor (DNA/RNA) or Using Sequence Editor (Protein)。圖 左邊為文字窗口，右邊為圖譜窗口，下方為序列窗口 圖譜窗口 文字窗口 序列窗口 　　 　 　這三個窗口為文字窗口、圖譜窗口和序列窗口。但用戶 IP 位置必須位于海洋大學校內(nèi)，方可與授權(quán)服務(wù)器聯(lián)機。 　數(shù)據(jù)庫建立和儲存序列　 在了解主程序的樣子之后，接下來必須要先了解 NTI 的數(shù)據(jù)是如何儲存和讀取， 并且建立自己的序列數(shù)據(jù)庫。欲開啟儲存的檔案只要連續(xù)點兩下就可以直接打開。 在 Options 可以調(diào)整我們想要搜尋的條件。圖 利用 Properties 進行編輯后的結(jié)果 如果是在文本塊下按鼠標右鍵， 并點選 Properties 可以進行對文字的編輯(圖 )：圖 利用 Properties 進行文字的編輯 (圖 )。窗口上方的 Table 指令可 以調(diào)整轉(zhuǎn)譯功能的相關(guān)參數(shù)設(shè)定，Camera 指令可以輸出反轉(zhuǎn)譯的序列。除此之外， 選項之 使用者還可以利用內(nèi)建的序列和限制酶建立屬于自己的 Marker。 　 使用者如果要進一步分析引子的特性可以點選 Analyze 功能：圖 編輯與分析引子數(shù)據(jù) 　 如圖 所示，左手邊可以先設(shè)定分析的條件，接著按下 Analyze 右邊的字圖 左邊字段為設(shè)定分析的條件，右邊字段顯示分析的結(jié)果 段就會顯示分析的結(jié)果： 　 最右邊的窗口會顯示該引子回紋以及重復(fù)片段位置， 其分析的條件在左手邊 字段中的 Palindroms 以及 Nucl. Repeats 這兩個選項；使用者還可以點選 (圖 )：圖 分析 Dimers amp。圖 貼上欲分析的序列 (Basic Local Alignment Sear