【正文】 ；MEGABLAST 可以用在非常相似， 近乎完全相同的核酸序列搜尋， 也就是只比對接近百分之百的序列。； ） tblastn 是指將使用者的胺基酸序列反轉(zhuǎn)譯成為核酸序列后再去和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫做比對，注 意這個(gè)項(xiàng)目之下會(huì)因 6 Frame Translation 的緣故出現(xiàn)六種不同的核酸序列。圖 貼上欲分析的序列 (Basic Local Alignment Search Tool) 接下來要進(jìn)行 BLAST 相關(guān)的設(shè)定(圖 )：圖 BLAST 相關(guān)設(shè)定工具 首先使用者要先設(shè)定 Program(圖 )的項(xiàng)目：圖 BLAST 中的 Program 有 5 個(gè)項(xiàng)目，代表不同比對方式 　　　　　　　　 這 5 個(gè)項(xiàng)目(圖 )所代表的比對方式會(huì)有所不同： blastn 是指把欲分析的序列和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫做比對，當(dāng)用戶欲分析的序列是 DNA 或者是 RNA 時(shí)適用此項(xiàng)目； blastp 是指將欲分析的序列去和 NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫做比對，當(dāng)用戶欲分析胺基酸序列時(shí) 　 適用此項(xiàng)目； blastx 是指把使用者的核酸序列轉(zhuǎn)譯成胺基酸，再和 NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（會(huì)有 六個(gè)不同的胺基酸序列，正股三個(gè)，反股三個(gè)。 　 用戶可以在 NTI 的附屬程序(圖 )下找到 BLAST Search：圖 使用附屬程序內(nèi)的 BLAST Search 工具 也可以從主程序上方 Tools 的項(xiàng)目進(jìn)入(圖 )：圖 使用 Vector NTI 主程序開啟 BLAST Search 的功能 (圖 )，詢問使用者欲連結(jié)至哪一個(gè)服務(wù)器進(jìn)行分析，使用 者只要點(diǎn)選上方的 NCBI BLAST Sever 就可以了，然后按下 OK 進(jìn)入 BLAST 程序：圖 跳出詢問鏈接至服務(wù)器的窗口，選擇 NCBI BLAST Server 就可以 進(jìn)入 BLAST 程序之后用戶可以看見一個(gè)操作的窗口，大致上會(huì)被分成兩個(gè)區(qū)塊(圖 )： 上方的字段是輸入使用者欲分析的序列；下方的字段是可以顯示分析的結(jié)果。設(shè)計(jì)引子時(shí)多 嘗試不同的條件配合 NTI 軟件進(jìn)行分析，如此用戶較有機(jī)會(huì)得到最佳的引子。 Multiplex PCR List：和 Add to Oligo List 功能差不多，只是直接把欲分析引子的序 列加入暫存窗口內(nèi)進(jìn)行引子分析的功能(圖 )：圖 使用 Multiplex PCR List 分析的結(jié)果 ：此功能將在多重序列比對的部分再進(jìn)行說明。此功能操作接口和 Find 圖 Amplify Features 的設(shè)定 PCR Primers 一樣，只差了一個(gè) Features 的選項(xiàng)(圖 )： 　 用戶只要按下 Add 的按鈕把用戶畫在圖形上的 Features 加進(jìn)去，再按下確定 就可以分析出 Features 的引子序列了(圖 )：圖 使用 Amplify Features 分析的結(jié)果 ：也和 Find PCR Primers 功能幾乎相同，差異的地方 只是在于在中央間出現(xiàn) Sense Primers 和 Antisense Primers 選項(xiàng)，用戶可以把儲(chǔ)存 的引子檔案加入到設(shè)計(jì)的窗口(圖 )中：圖 將儲(chǔ)存的引子檔案加入設(shè)計(jì) 　 其他操作功能和 Find PCR Primers 都是一樣的。 Amplify Selection：此功能和 Find PCR Primers 幾乎一樣，差別只是在于引子 的設(shè)計(jì)位置會(huì)落在用戶所選擇序列范圍端點(diǎn)跟端點(diǎn)的前后片段：圖 Amplify Selection 的設(shè)定 　 這個(gè)窗口(圖 )下使用者想要夾 400bp 到 800bp 的片段，引子的設(shè)計(jì)落點(diǎn) 會(huì)在這個(gè)范圍前后兩端，在 Before 跟 After 的選項(xiàng)用戶可以把引子的分析點(diǎn)從端 點(diǎn)的前后推進(jìn)來進(jìn)行分析（也可以不用設(shè)定，這樣子引子只會(huì)落在分析范圍的端 點(diǎn)內(nèi)） ，程序會(huì)分析出最佳的引子落點(diǎn)（大約涵蓋在端點(diǎn)序列前后部份） ，其他操 作方式和 Find PCR Primers 是相同的(圖 )。分析的結(jié)果可以點(diǎn)選 Save Results 儲(chǔ)存，在此建議引子設(shè)計(jì)完成后，可以在 分析的窗口進(jìn)行引子序列的修飾， 讓使用者的引子更接近所需要的條件以及降低 dimer 跟 hairpin Loop 形成的可能性。 　 NOTE： 在做引子設(shè)計(jì)的時(shí)候盡量減少 dimer 和 hairpin Loop 的產(chǎn)生， 因?yàn)?dimer 和 hairpin Loop 會(huì)降低使用者 PCR 的效率。 　 使用者如果要進(jìn)一步分析引子的特性可以點(diǎn)選 Analyze 功能：圖 編輯與分析引子數(shù)據(jù) 　 如圖 所示，左手邊可以先設(shè)定分析的條件，接著按下 Analyze 右邊的字圖 左邊字段為設(shè)定分析的條件，右邊字段顯示分析的結(jié)果 段就會(huì)顯示分析的結(jié)果： 　 最右邊的窗口會(huì)顯示該引子回紋以及重復(fù)片段位置， 其分析的條件在左手邊 字段中的 Palindroms 以及 Nucl. Repeats 這兩個(gè)選項(xiàng)；使用者還可以點(diǎn)選 (圖 )：圖 分析 Dimers amp。Add to Oligo List 功能和 Add to Gel Sample List 功能類似，一樣會(huì)把引子數(shù)據(jù)暫存在窗口中，以便于進(jìn)一步的分析。 在每組的正向和反向引子下方會(huì)顯示序列的相關(guān)數(shù)據(jù)， 用戶想要儲(chǔ)存結(jié)果只要選 取引子，接著按下鼠標(biāo)右鍵：圖 選取序列字段后右鍵單擊，對引子進(jìn)行儲(chǔ)存動(dòng)作 　 使用者可以點(diǎn)選 Save To Database(圖 )：圖 儲(chǔ)存引子到數(shù)據(jù)庫 　 存取方式和前一章所介紹的作法是完全相同的，存盤的默認(rèn)路徑指向 Local Database 中的 Oligos 文件夾里 （如同前一章所介紹的方式， 使用者也可以在 Local Database 中建立屬于自己的引子檔案夾） 如果想要輸出序列， 。若要在引子兩端加入限制酶剪切序列 可以點(diǎn)選 ：圖 Find PCR Primers 進(jìn)階設(shè)定，在引子兩端可加入限制酶剪切序列 　 使用者可以在下方 Attach to 5’terminus(圖 )點(diǎn)選 加入欲設(shè)定的限制酶 即可；上方 UserDefined Primers 的項(xiàng)目可以把在 Local Database 中現(xiàn)有的引子資 料直接使用。 　 Find PCR Primers：進(jìn)入這個(gè)項(xiàng)目后用戶會(huì)先看到一個(gè)窗口(圖 )：圖 Find PCR Primers 窗口，要進(jìn)階設(shè)定，點(diǎn)選 More 　 使用者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求來設(shè)定相關(guān)的條件：上方 Region of Analysis 可以 填入欲分析的序列范圍；Product Length 可以設(shè)定使用者 PCR 所夾的序列長度。首先在主程序中用戶將 PCR 反應(yīng)的區(qū)段序列用光標(biāo)選取，接 著進(jìn)入 Analyses→Primer Design(圖 )：圖 選取 PCR 反應(yīng)的區(qū)段，設(shè)計(jì)特定核酸引子 　 此項(xiàng)目可以提供用戶根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行引子設(shè)計(jì)。 （和自己建立 Marker 的作法相同） ：圖 將選取的數(shù)據(jù)當(dāng)作 Marker ：上一章提到 RFLP 時(shí)，有個(gè) Create Gel 的指令(圖 )，點(diǎn)選后就會(huì) 變成膠片電泳分析的操作畫面：圖 使用 Create Gel，進(jìn)行膠片電泳分析 　 藉由此操作模式，可以直接觀看電泳分析的結(jié)果，對于要經(jīng)常分析 RFLP 的使用者來說，是非常實(shí)用的功能。 　 Add to Gel Sample List：這一項(xiàng)功能可以將用戶欲分析的電泳片段存取在一 個(gè)程序內(nèi)建的數(shù)據(jù)窗口，用戶可以利用此窗口進(jìn)行快速存取，接口十分友善。除此之外， 選項(xiàng)之 使用者還可以利用內(nèi)建的序列和限制酶建立屬于自己的 Marker。使用者打開左邊的文件夾后，會(huì)見到 電泳分析的結(jié)果；右手邊膠片數(shù)字編號的部分，按下鼠標(biāo)右鍵后也可以見到電泳 分析的結(jié)果(圖 )：圖 打開左窗口的檔案，于右窗口得到電泳分析結(jié)果 　 使用者還可以計(jì)算被限制酶剪切的片段在膠片上分離的時(shí)間， 只要用鼠標(biāo)選 就可以了(圖 )： 取欲分析之片段，再按下 圖 剪切限制酶的片段，進(jìn)行片段的電泳分析 　 電泳圖的顏色和線條可以進(jìn)行編輯，用戶只要在左邊窗口(圖 、)中 選項(xiàng)進(jìn)行編輯： 的文件夾按下鼠標(biāo)右鍵或是點(diǎn)選 圖 在文件夾按鼠標(biāo)右鍵，以編輯電泳圖的顏色或線條 圖 設(shè)定電泳圖的線條 ，使用者可以在 Local Database 里 面設(shè)定使用者自己的 Marker(圖 )：圖 選取自己數(shù)據(jù)庫的 Marker 　 用戶在 Local Database 的窗口(圖 )中點(diǎn)選 Gel Markers 選項(xiàng)，就可以自行 加入新的 Marker 檔案，用戶將 Marker 的數(shù)據(jù)設(shè)定好之后按下確定即可。使用者點(diǎn) 選項(xiàng)就可以選擇 Marker(圖 )：圖 選擇所要制作的膠片 (圖 )：圖 加入膠片之后的結(jié)果，呈現(xiàn)在右邊窗口 　 接著加入使用者的樣品，只要點(diǎn)選 　 選項(xiàng)即可： 圖 加入使用者樣品 此設(shè)定窗口(圖 )和上一章所提到的 RFLP 設(shè)定完全相同，用戶只要選取數(shù) 據(jù)庫中的基因序列及限制酶后，再按下 Add to Gel 就可以加入膠片中了： 　 此窗口(圖 )樣品和限制酶一樣可以復(fù)選， 使用者可以針對不同的需求進(jìn)行 調(diào)整，要放入膠中的分析物只要按下 Add to Gel，選取完所有的樣品后關(guān)閉此窗 口就可以進(jìn)行電泳分析，把光標(biāo)移至電泳片上方：圖 加入樣品后的結(jié)果，電泳分析的結(jié)果 　 使用者可以見到上方有一個(gè)時(shí)間軸的按鈕 ，只要點(diǎn)最 ，時(shí)間旁邊的兩個(gè)按鈕可以手動(dòng)控制電泳分析的時(shí) 間：圖 控制電泳分析時(shí)間，分析不同的時(shí)間點(diǎn) 　 若要停止電泳分析只要在膠片上面在點(diǎn)一下鼠標(biāo)左鍵就可以了。點(diǎn)選 　 此窗口中用戶可以設(shè)定電泳的條件，例如電泳片的大小、種類、電壓、緩沖 液等；在左下角的 View Parameters 選項(xiàng)可以設(shè)定電泳運(yùn)作的時(shí)間。點(diǎn)選 完畢之后再按下 Start： 　 分析的結(jié)果會(huì)以一個(gè)窗口顯示(圖 )，用戶可以按 Print 打印結(jié)果，或是按 Save 儲(chǔ)存。選擇好之后按下 Calculate 程序就會(huì)顯示分析后的結(jié)果(圖 )：圖 利用 RELP 顯示出所選取的分析結(jié)果 　 　 窗口中 Create Gel 的項(xiàng)目往后會(huì)再進(jìn)一步介紹。 RFLP：這個(gè)項(xiàng)目可以比較分析同一限制酶對不同序列切出來的片段數(shù)目(圖 )：圖 利用 RELP 比較分析同一限制酶對不同序列切出來的片段數(shù)目 　 左邊的項(xiàng)目為其他的序列（可復(fù)選） ，這些序列數(shù)據(jù)是已經(jīng)內(nèi)建或是儲(chǔ)存在 Local Database 中， 用戶可以在 Subset 項(xiàng)目中轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)。在主程序中，開啟上方 Analysis 選項(xiàng)進(jìn)入 Restriction Analysis：圖 限制酶切位和切割后的片段分析 　 在 Restriction Sites 的選項(xiàng)中用戶可以設(shè)定欲分析的限制酶：圖 利用 Restriction Sites 選項(xiàng)設(shè)定欲分析的限制酶 　 在窗口的左邊是程序默認(rèn)的限制酶(圖 )，欲進(jìn)行調(diào)整可以點(diǎn)選 Remove 或 是 Remove All 移除。窗口上方的 Table 指令可 以調(diào)整轉(zhuǎn)譯功能的相關(guān)參數(shù)設(shè)定，Camera 指令可以輸出反轉(zhuǎn)譯的序列。 　 Back Translation：此功能能夠幫助用戶把胺基酸序列反轉(zhuǎn)譯成為 DNA 序列， 使用者只要選取欲分析之片段，接著執(zhí)行 Analyses→Back Translation 即可，執(zhí)行 反轉(zhuǎn)譯功能后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新窗口(圖 )：圖 利用 Back Translation 將胺基酸序列反轉(zhuǎn)譯為 DNA 序列 　 窗口上方的序列是原本的胺基酸序列，下方是進(jìn)行反轉(zhuǎn)譯后所產(chǎn)生之 DNA 序列，我們可以根據(jù)物種的不同來進(jìn)行條件的設(shè)定，Translation Table 可以下拉選 擇物種。除此之外最下面多了一個(gè) ORFs 的功能，這個(gè)功能可以幫助我們 分析序列的 Open reading frame： 首先使用者需先將分析 Open reading frame(圖 ) 的功能打開。 　 Feature(圖 )：這個(gè)選項(xiàng)的功能和上述功能很接近，差別只是在于用戶可 以利用此功能直接轉(zhuǎn)譯序列中的某特定區(qū)段， 只要把光標(biāo)點(diǎn)選欲分析的區(qū)塊就可 以執(zhí)行此功能：圖 利用 Feature 工具，可以直接轉(zhuǎn)譯序列中所選取的部分 　　 CDS with Splicing：這個(gè)項(xiàng)目將在日后進(jìn)行 Intron、Exon 分析時(shí)再進(jìn)行更進(jìn) 一步的說明。 圖 取消 DNA 序列轉(zhuǎn)成胺基酸 ，輸出后必須 要再調(diào)整字型跟格式。 　 如此一來我們就有一張漂亮的序列圖形，可以應(yīng)用在報(bào)告或論文寫作上了。 圖形的輸出：在畫好圖片后，要如何從 Vector NTI 中輸出呢？我們只要執(zhí)行 指令(圖 )就可以將圖形復(fù)制，操作方式同上一章所述。所輸入的文字也可以進(jìn)行相關(guān)的調(diào)整： 圖 為圖形增加文字批注 　 按下 OK 就會(huì)顯示在圖譜窗口上(圖 )， 所輸入的文字批注也會(huì)在文字窗口 中出現(xiàn)。圖 利用 Properties 進(jìn)行編輯后的結(jié)果 如果是在文本塊下按鼠標(biāo)右鍵， 并點(diǎn)選 Properties 可以進(jìn)行對文字的編輯(圖 )：圖 利用 Properties 進(jìn)行文字的編輯 (圖 )。我們要在序列標(biāo)示特定標(biāo)記時(shí)，先將光標(biāo)移至圖譜窗口，接著按下 指令會(huì)出現(xiàn)圖 ：圖 編輯圖形設(shè)定 　 在窗口中左邊是程序已經(jīng)內(nèi)建好的圖形， 每一個(gè)圖形代表著序列種種不同的 生物功能；右邊我們可以編輯圖形的范圍和命名，設(shè)定好以后按 OK 就可以了。在上方 Analysis→Restriction Analysis→Restriction sites 中點(diǎn)選 Remove ALL 再按 OK 就可以了。圖譜 大小用 來放大縮小圖片，可以依照個(gè)人喜好調(diào)整。 　 將光標(biāo)點(diǎn)擊圖譜窗口之后可以見到下列指令： 這些指令中有一些和 上一章序列窗口有類似的功能，在此便不加以重述。 ，可以進(jìn)入上方 View 選項(xiàng)(圖 )：圖 使用 View 選項(xiàng)，改變主程序中窗口的位置 　 　最下面的三個(gè)指令( Change panes layout, Maximize Pane, Switch to standard layout )(圖 )可依個(gè)人喜好更改窗口的位置和排列方式。 要把刪去的序列貼回只要再把光標(biāo)移動(dòng)到默認(rèn)的位置上方 按下 ， 或是 Edit→Paste Sequence at * bp 就可以貼回序列。在主程序 Edit