【正文】 應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比 。 P157 抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合 蛋白。 第七節(jié) 抗體治療藥物 抗體治療藥物有哪些？ P173 以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。植物組織培養(yǎng)時表面處理的常用滅菌劑是次氯酸鈣、次氯酸鈉、氯化汞。P199 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器 P201 （ 1）機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：反應(yīng)器內(nèi)溫度、 PH、溶氧及營養(yǎng)物物濃度易控制。（ 7）抗體酶、核酸酶的研究。交聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法 。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。③ 分子印跡聚合物還可在生物傳感器的構(gòu)建中作為傳感器，這種聚合物可作為通常使用的生物材料的替代物。 選擇溶劑體系和有機(jī)溶劑的種類要根據(jù)酶的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的溶解度及反應(yīng)器的型式 等具體情況而定。 （ 2）種子制備：菌種的擴(kuò)大化培養(yǎng)。 第五節(jié) 發(fā)酵工藝控制 影響發(fā)酵的主要因素有哪些？如何對發(fā)酵過程進(jìn)行控制？ P269 （ 1）培養(yǎng)基 的影響及控制：配制合適成分的培養(yǎng)基（碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素和水），特別是碳氮比要適宜 （ 2）溫度的影響及控制：有最適生長溫度和最適發(fā)酵溫度；通過在發(fā)酵罐夾套或蛇管中流冷、熱介質(zhì)進(jìn)行控溫。兩 個原生質(zhì)體融合后，必須涂布于再生培養(yǎng)基上，使其再生。 （ 2）水 — 水不溶性溶劑兩相體系：有機(jī)溶劑在水中的溶解度盡可能小。 P235 主 客體化學(xué)和超分子化學(xué)是酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。 ②離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。（ 2）酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究。 （磷、氮；銅是次級代謝產(chǎn)物積累的必要元素） ③ 碳源：糖是使用最廣、作用最強的碳源，對次級代謝產(chǎn)物影 響主要取決于使用的糖種類、糖濃度及其次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。 第五章 植物細(xì)胞制藥 第一節(jié) 基本概念 植物細(xì)胞的全能性。能測出 ng/ml，甚至 pg/ml 水平的微量抗原物質(zhì)。其分子量僅為整個 Ig 分子的 1/12。 ELISA 法 ：酶聯(lián)免疫吸附試驗 ，基本方法是 將已知 的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。 ②用抗原 免疫脾細(xì)胞的制備 ：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法 。） （ 3）灌流式操作 （該方式是當(dāng)細(xì) 胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將 部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。優(yōu)點是操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，不但細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較低。該細(xì)胞株仍具備“正?！奔?xì)胞的特點，一般均從動物的胚胎組織中獲取。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠 L929 細(xì)胞。 第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成 P63 包涵體：指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等 有害效應(yīng)。適當(dāng)提高 pH，可減少乙酸的抑制作用 ； P31 第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性 質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類？ P32 工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為 分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。 ③ SD 序列和起始密碼 ATG 的間距 ：表達(dá)非融合蛋白的關(guān)鍵是原核 SD 序列和真核起始密碼ATG 之間的距離，距離過長過短都影響真核基因的表達(dá)。其內(nèi)毒素很難除去。 基因工程藥物制造的主要程序 （過程）（重點和后面幾節(jié)聯(lián)系起來） （ 1）目的基因的克隆 （分離目的基因）： 通過逆轉(zhuǎn)錄、 反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)合成方法來制備 cDNA， 再通過核酸探針雜交或免疫反應(yīng)來篩選目的基因 （ 2）目的基因與載體連接構(gòu)建 DNA 重組體： 通過限制性內(nèi)切酶 DNA 連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的相關(guān)克隆位點，常用的載體有質(zhì)粒載體和 噬菌體載體 （ 3）將 DNA 重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌：常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處于感受態(tài)，再通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式把重組 DNA 導(dǎo)入宿主菌，以構(gòu)建工程菌 （ 4）工程菌發(fā)酵： 提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、反應(yīng)器、控制好 發(fā)酵過程中的各種參數(shù)，如溫度、 PH、溶氧等，并通過升溫來誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá) （ 5）目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化： 通過固液分離、初 步純化、高度純化、成品加工來制備產(chǎn)品；若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細(xì)胞破碎，若是包涵體則需要變性和復(fù)性 （ 6）產(chǎn)品的檢驗 ： 檢測產(chǎn)品的質(zhì)量和性能 。生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題 第一章 緒論 第一節(jié) 生物技術(shù)的發(fā)展史 生物技術(shù) ：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結(jié)合，利用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品服務(wù)的一個綜合性技術(shù)體系。 第三節(jié) 目的基因的獲得 利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？ P16 （ 1）逆轉(zhuǎn)錄法 以 mRNA 為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到 cDNA，構(gòu)建 cDNA 文庫，從 cDNA 文庫中篩選目的基因。 ⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。 ④ 密碼子組成：應(yīng)選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子。 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定 是指工程菌在分裂時出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。色譜技術(shù)分為離子 交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高 壓液相色譜等。 包涵體的分離和溶解 P63 （ 1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（ 脲或鹽酸胍）、去垢劑（ Triton X100）、脫氧膽酸鈉洗滌。 什么是接觸抑制現(xiàn)象？ P84 當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時， 細(xì)胞就停止增殖。 (3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞 這類細(xì)胞是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，它常常由于染 色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔?xì)胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。 （目前在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌罐式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分 條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細(xì)胞。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)， B 細(xì)胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細(xì)胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細(xì)胞。 原理： 酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。 VH或 VL （ 7）最小識別單位：即 MRU，只含有 一個 CDR 多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。 常 用的標(biāo)記抗體試劑： a、 HBsAg 放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度 ng/ml b、 HBeAg 放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度 ng/ml c、 HAV 抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記 d、 AFP 放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度 1~5 ng/ml e、 CEA 放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度 1 ng/ml 導(dǎo)向診斷藥物 由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導(dǎo)向藥物 還未愛臨床廣泛應(yīng)用。 P177 植物體中任何一個具有完整細(xì)胞核（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個體。 ④ 植物生長調(diào)節(jié)劑：不同植物激素及其不同組合形式均可顯著影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。（ 3）酶生產(chǎn)中基因工程的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究。 ③共價結(jié)合法：酶以共價鍵結(jié)合于載體上。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。 P236 模擬酶的分類 P236 （ 1）根據(jù) Kirby 分類法：單純酶模型、機(jī)理酶模型、單純合成的酶樣化合物 （ 2）主 客體酶模型：主 客體酶（環(huán)糊精 CD）、膠束酶模型、肽酶、分子印跡酶模型、半合成酶 何謂分 子印跡？分子印跡的應(yīng)用范圍有哪些？ P238 分子印跡 ：指制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程，該特定分子稱為印跡分子或模板。在該體系中，要求底物在水和有機(jī)溶劑中的溶解度盡可能大，而產(chǎn)物在水中的溶解度要小。 （ 4） 融合子的 篩選： 依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記，有二個遺傳標(biāo)記互補，就可確定其為融合子。 （ 3） PH 的影響及控制：有最適生長 PH 和最適發(fā)酵 PH；通過加酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)調(diào)節(jié) PH，也可補料來調(diào)節(jié) （ 4）溶氧的影響及控制：根據(jù)微生物對氧的需求來控制溶氧濃度；調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率來。為防止菌種衰退，需把菌種進(jìn)行保藏，并且還需不斷純化。 （ 4）單相有機(jī)溶劑體系：在該體系中，不存在單獨的水相，只含極微量的水，即在酶分子周圍存在著一層水分子膜，以維持催化反應(yīng)所必需的構(gòu)象。② 在酶技術(shù)和有機(jī)合成中，分子印跡聚合物可作為模擬抗體，模擬酶或具有催化活性的聚合物。②最適 pH：最適 pH 可能變大，也可能變小；③最適溫度：一般升高。 （ 2）交聯(lián)法： 用雙功能或多功能試劑使酶與酶或細(xì)胞與細(xì)胞之間交聯(lián)的方法。（ 6）酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)和應(yīng)用研究。 P197 第六節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器 植物細(xì)胞反應(yīng)器的選擇取決于：生產(chǎn)細(xì)胞的密度、通氣量、提供的營養(yǎng)成分的分散程度。P183 （ 1）生長階段特征 ? 延遲期：細(xì)胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快 ? 加速期：最大生長期，最大細(xì)胞濃度 ? 對數(shù)期：細(xì)胞數(shù)呈對數(shù)增加 ? 穩(wěn)定期：細(xì)胞高液泡化，非常脆弱 （ 2）植物細(xì)胞與動物細(xì)胞、微 生物細(xì)胞比較 特征 哺乳動物細(xì)胞 植物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 大小（ μm） 10~100 10~100 1~10 生長 懸浮、貼壁 懸浮 懸浮 營養(yǎng)要求 很復(fù)雜 較復(fù)雜 很簡單 生長速度（倍增時間：h） 慢； 15~100 慢； 20~120 快； ~5 細(xì)胞分化 有 有限分化 無 環(huán)境影響 非常敏感 敏感 一般 細(xì)胞壁 無 有 有 產(chǎn)物存在部位 胞內(nèi)或胞外 胞內(nèi)或胞外 胞內(nèi)或胞外 產(chǎn)物濃度 低 低 高 含水量 約 90 約 75 供氧需求 1~25 20~30 100~1000 產(chǎn)物種類 疫苗、單抗、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑 酶、天然色素、天然有機(jī)化合物等 發(fā)酵食品、抗生素、有機(jī)化合物、酶等 第四節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù) 植物材料的準(zhǔn)備 ； P185 植物組織培養(yǎng)的外植體必須是無雜菌材料。人 CD 的編號已從 CD1 命名至 CD247，大致分為 13 組。 P155 多功能抗體：在 scFv 的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的 scFv 重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。 ②脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合： 脾細(xì)胞（ 1 108）和骨髓瘤細(xì)胞（ 2 107）混合，在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合 2 分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（ 2）具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。較容易采用灌流 培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度。 (4)其他：融合細(xì)胞系（物理法如高壓電場和化學(xué)法如仙臺病毒、聚乙二醇）和重組工程細(xì)胞系 真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建，使用的載體有兩類：（ 1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；（ 2）質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體 P88 重組 DNA 導(dǎo)入動物細(xì)胞的常用方法：融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法，最常用 磷酸鈣沉 淀法、 電穿孔法 P89 生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫（ MCB）、生產(chǎn)用細(xì)胞庫（ MWCB）或工作細(xì)胞庫（ WCB） P91 第四節(jié) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件 P92 (1)器材的清洗和消毒 ①器材的清洗 :浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 ②器材的消毒滅菌 : 物理消毒 /化學(xué)消毒 (2)水質(zhì) :電阻值大于 18MΩ ,去熱原。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn) 象隨之消失，細(xì)胞可多層生長。 （ 3）包涵體復(fù)性：稀釋復(fù)性和透析復(fù)性；含二硫鍵的蛋白的復(fù)性；封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性；凝膠過濾層析復(fù)性；小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性；分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性；人工分子伴侶的復(fù)性 第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控 制 由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時，常作那些項目分析？ P68 （ 1）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)后，對生成的肽段進(jìn)行的分離分析。 它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫 2 種）、再生 4 個主要步驟構(gòu)成。 基 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 P33 （ 1）選擇合適的 宿主菌：遺傳穩(wěn)定（ 2）選擇合適的載體：高拷貝數(shù)；（ 3）選擇壓力：如加抗生素