【正文】 ② 優(yōu)點 ：使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質濃度；和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴格的無菌條件；不會產生菌種老化和變異等問題。 （ 3）發(fā)酵 ① 培養(yǎng)基和發(fā)酵設備滅菌 ②接入 5%20%的菌種 ③ 在發(fā)酵罐內進行發(fā)酵 ④需對發(fā)酵罐內各種條件進行控制以保證發(fā)酵正常進行：溶氧（通氣攪拌）、罐壓、溫度、 PH 、泡沫等 發(fā)酵周期因品種而異 （ 4）產物提取 ①發(fā)酵液的預處理和過濾；②提??；③精制 第四節(jié) 發(fā)酵方式 發(fā)酵的操作方式和特點 ； P268 （ 1）分批發(fā)酵 ①定義： 營養(yǎng)物和菌種一次加人進行培養(yǎng)，直到結束放出，與外部沒有物料交換 的培養(yǎng)方式。為了防止原生質體的破裂，要把原生質體釋放到高滲緩沖液或培養(yǎng)基中。它是利用現(xiàn)代生物學與化學的理論 與技術交叉研究的成果，是 抗體的高度選擇性 和酶的高效催化能力 巧妙結合的產物。 有機相酶反應的溶劑體系各是什么？如何選擇溶劑體系和有機溶劑的種類？ P248 按照溶劑體系的組成和特點，目前有機相酶反應主要有 4 種溶劑體系。但是，酶是蛋白質，存在其異體蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和抑制劑作用、在體內半衰期短等缺點，嚴重影響使用效果。 （ 6）連續(xù)流動攪拌罐 超濾膜反應器 （ 7）其它反應器 第四節(jié) 酶的人工模擬 人工模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用各種方法人為制造的均有酶性質的催化劑。⑤最大反應速度（ Vm）：變化很小 或不變。 固定化酶的性質（變化 ） P228 （ 1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。 （ 3）包埋法： ①網(wǎng)格型：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。 （ 2）特點：有細胞特性，既有生物催化劑功能，又有固相催化劑特點。 目前工業(yè)上應用的酶大多采用 微生物發(fā)酵法 來生產 。 （生物轉化：利用離體培養(yǎng)細胞或器官及細胞器等對外源化合物進行結構修飾而獲得有價值產物的生理生化反應） 第六章 酶工程制藥 第一節(jié) 概述 酶工程：從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶 的特異催化性能，并通過工程化將相應原料轉化成有用物質的技術。 （ 3）氣升式生物反應器：低剪切力，混合與氧傳遞效果好，運動部件不易染菌，操作費用低，但是高密度培養(yǎng)時候混合不夠均勻 。 第五節(jié) 影響植物次級代謝產物激積累的因素 影響植物次級代謝產物積累的因素有哪些？ P192 （ 1）生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等 （ 2）物理條件：溫度、光（強度、時間、光質）、通氣、 PH 和滲透壓 （ 3）化學條件：無機鹽、碳源、生長調節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸 、抗生素、天然物質、前體等 （ 4）工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌、培養(yǎng)方法等 重要影響因素 P193 （一）外植體選擇：不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產物的累積時間各異。高濃度生長素和低濃度分裂素刺激細胞分裂，而低濃度生長素和高濃度分裂素刺激細胞生長。特異性好、穩(wěn)定性強、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到 診斷和定位的目的。 P159 現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為 抗體庫技術的載體 。（ Fd：重鏈 V 區(qū)及 CH1功能區(qū)） 完整 L 鏈 +重鏈 V 區(qū) +CH1 功能區(qū) （ 4） Fv 抗體 ：由 VH 和 VL 組成的具有完整抗原結合位點的最 小抗體片段； VH+VL （ 5） 單鏈抗體：即 scFv，由 VH 和 VL 通過連接肽（接頭）重組并表達而成的一種小分子抗體，其分子量 為整個 Ig分 子的 1/6具有較好的抗原結合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性 。 P150 Ig分子結構 P150 （ 1） 由 2 條重鏈 (簡稱 H 鏈 )和 2 條輕鏈 （ 簡稱 L 鏈 ） 組成 Y字型結構分子 ，鏈與 鏈之間由一對或一對以上的二硫鍵互相連接 （ 2） Ig 分子氨基酸端 L 鏈 的 1/2 與 H 鏈 的1/4 的氨基酸組成及順序多變，構成 可變區(qū)(簡稱 V 區(qū) )， V 區(qū) 中某些特定位置構建抗體和抗原特異結合的 關鍵部位，稱為互補決定區(qū)（ CDR） 它賦于抗體以特異性 。 體內誘生法單克隆抗體的純化方法： ①離心 取上清，超濾，鹽析。其上脾 — 瘤融合細胞可以生長，脾 — 脾、瘤 — 瘤融合細胞死亡。 P148 什么是單克隆抗體？它是如何制備的？ P144 （ 1） 抗原與動物免疫 ①制備高純度抗原： 抗原可以用化學合成，如精制地高辛。 動物細胞生物反應器的類型及特點 ； P108 （ 1） 攪拌罐式生物反應器（目前最廣泛應用的動物細胞反應器 ）： 靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性 （ 2）氣升式生物反應器： 其特點是結構簡單，操作方便。） （ 2）半連續(xù)式操作 （該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一 段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數(shù) 量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。 ② 包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內。常用的 消化液 有 ％的 胰蛋白酶 液。 （ 1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等 ,成分復雜、成分不穩(wěn)定 （ 2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應， DME、 MEM、 DMEM 等（第一個合成培養(yǎng)基是 199 培養(yǎng)基；①氨基酸： 12 種必需氨基酸 +谷氨酰胺②維生素：形成輔基和輔酶③糖類：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④無機鹽：維持滲透壓⑤其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽⑥添加 5%～ 10%小牛血清：作用是提供生長因子和激素；提供貼附 因子和伸展因子；提供結合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素 （ 3） 無血清培養(yǎng)基： 無血清培基的優(yōu)點如下：① 提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批間差異的影響。用得最多的是雞胚細胞，原代兔腎或鼠腎細胞，以及血液的淋巴細胞。 周期 =間期 +分裂期 間期（ G1+S+G2） 分裂期（ M） （ 2）細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現(xiàn)象 (3)正常二倍體細胞的生長壽命是有限的 (4)動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感。如淋巴細胞。 （ 3）部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析（ N 端 15 個氨基 酸）可作為重組蛋白質和多肽的重要鑒定指標。 (4)兩個技術之間不需要對物料加以處理或調整，這樣可以減少工藝步驟。常用的介質是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。 （ 4）產品質量的要求 細胞破碎與固液分離 ⑴細胞收集： 離心法 、膜分離法。 第九節(jié) 高密度發(fā)酵 什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法實現(xiàn)高密度發(fā)酵？ P41 （ 1） 高密度發(fā)酵：一個相對概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在 50gDCW/L 以上，理論上的最高值可達 200gDCW/L。 精確表達載體 ： 要求在啟動子或前導肽編碼序列的適當部位有內切酶位點，以利于接入外源基因，并使它在表達和加工后氮末端氨基酸序列與天然產物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸 的克隆載體。 ⑵以 非融合蛋白 的形式表達藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的 mRNA 的 AUG 為起始，在其氨基端不含細菌多肽序 列。需要尋找強的啟動子。 第二類為真核細胞（常用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等） ⑴酵母：酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。蛋白質不能糖基化。 （ 3） cDNA 克?。豪煤线m的連接方法，將產生的雙鏈 cDNA 片 段插入到合適的載體中。 （ 3）酶工 程制藥 ：酶與細胞的固定化及酶轉化制藥 （ 4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改進、新藥研制、菌種改造。 P4 生物技術藥物 ：采用 DNA 重組技術活其他生物技術研制的蛋白質或核酸類藥物?；蚬こ淌巧锛夹g的核心。 第三節(jié) 生物技術制藥 生物技術制藥的特征 ：高技 術、高投入、長周期、高風險、高收益。但是， cDNA 只包含蛋白質的結構基因部分，缺少有關的調控序列 ，因此在原核系統(tǒng)中表達，還需要根據(jù)表達載體的結構，配以相應的調控序列。 P20 基因高效表達研究：指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中， 使其能獲得原生物活性又可高產的表達產物。有很強的胞外蛋白酶對產物降解。 P22 大腸 桿菌基因表達載體 P23 （ 1） pBV220 系統(tǒng) pBV220 系統(tǒng)國內使用最多的載體 ,其組成 ： ①來源于 pUC8 多克隆位點 ； ②核糖體 rrnB 基因終止信號 ； ③ pBR322 第 4225～ 3735 位 ； ④ pUC18 第 2066～ 680 位 ； ⑤λ噬菌體 cIts857抑制子基因及 PR 啟動子 ； ⑥ pRC23 的 PL 啟動子及 SD 序列 （ 2） pET 系統(tǒng) 影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素 P22 外源基因表達產量與細胞濃度和細胞表達產量呈正相關。 （ 5）工程菌的培養(yǎng)條件 外源基因的高水平表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關，必須進行優(yōu)化。 表達載 體： 在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件 (如啟動子、 RBS、終止子等 )，是目的基因能夠表達的載體。 基 提高質粒穩(wěn)定性的方法 P33 （ 1）選擇合適的 宿主菌：遺傳穩(wěn)定（ 2）選擇合適的載體：高拷貝數(shù)；（ 3）選擇壓力：如加抗生素提高穩(wěn)定性；（ 4）分階段控制培養(yǎng)： 先使菌體生長至一定密度；再誘導外源基因的表達 （ 5）控制培養(yǎng)條件 （ 6）固定化 第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng) 基因工程菌的培養(yǎng)方式 P36 （ 1） 分批培養(yǎng) （ 2）補料分批培養(yǎng)： 將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng) ,經(jīng)過一段時間后間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。③生產工藝及條件。 它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫 2 種）、再生 4 個主要步驟構成。 用于分離純化的技術應滿足那些要求？ P62 (1)技術條件溫和，能保持目的產物的生物活性。 （ 3）包涵體復性：稀釋復性和透析復性；含二硫鍵的蛋白的復性；封閉蛋白的疏水蔟促進復性；凝膠過濾層析復性；小分子添加劑促進的復性；分子伴侶或折疊酶促進的復性；人工分子伴侶的復性 第十二節(jié) 基因工程藥物的質量控 制 由基因重組技術所獲得的蛋白質藥物產品進行鑒定時，常作那些項目分析？ P68 （ 1）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質后，對生成的肽段進行的分離分析。 P79 第二節(jié) 動物細胞的形態(tài)和生理特點 （重點） 離體培養(yǎng)的動物細胞分為那些類型？ P81 動物細胞適應功能 ,形態(tài)各異。一旦細胞轉化為異倍體后，該現(xiàn) 象隨之消失，細胞可多層生長。粗面內質網(wǎng)的核糖體合成蛋白質是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。 (4)其他：融合細胞系（物理法如高壓電場和化學法如仙臺病毒、聚乙二醇）和重組工程細胞系 真核細胞基因表達載體的構建，使用的載體有兩類：（ 1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒；（ 2）質粒載體：穿梭質粒載體 P88 重組 DNA 導入動物細胞的常用方法：融合法、化學法、物理法、病毒法，最常用 磷酸鈣沉 淀法、 電穿孔法 P89 生產用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：原始細胞庫（ MCB）、生產用細胞庫（ MWCB）或工作細胞庫（ WCB） P91 第四節(jié) 動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 動物細胞的培養(yǎng)條件 P92 (1)器材的清洗和消毒 ①器材的清洗 :浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 ②器材的消毒滅菌 : 物理消毒 /化學消毒 (2)水質 :電阻值大于 18MΩ ,去熱原。⑥ 減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于對實驗結果的分析。較容易采用灌流 培養(yǎng)的方式使細胞達到高密度。 （ 1）分批式操作 （一種是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內進行培養(yǎng)，此后細胞不斷增長，產物不斷形成和積累。（ 2）具有良好的傳質、傳熱和混合的性能。 單克隆抗體：將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的特異性完全相同的高純度抗體。 ②脾細胞和骨髓瘤細胞融合： 脾細胞（ 1 108）和骨髓瘤細胞（ 2 107）混合，在聚乙二醇誘導下融合 2 分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。另外還檢測抗體特異性、純度、分子量 等。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應?？上庖咴葱浴?P155 多功能抗體：在 scFv 的基礎上，可以把兩個或兩個以上的 scFv 重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。 P161 二、抗體診斷藥物有哪些類型？ P161 1. 血清學鑒定用的抗體類試劑 （ 1）鑒定病原菌用的抗體試劑 （ 2）乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg）的反向被動血凝診斷