【正文】 無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。 （ 2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。 （ 3）連續(xù)培養(yǎng) （ 4）透析培養(yǎng) （ 5）固定化培養(yǎng) 基因工程菌的培養(yǎng)工藝 P37 （ 1） 培養(yǎng)基的影響（ 2） 接種量的影響（ 3） 溫度的影響（ 4）溶氧量的影響（ 5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響（ 6）誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響： 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。 穿梭載體： 指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的 載體（ 例如既能在原核生物中復(fù)制 ,又能在真核生物中復(fù)制的載體 ）。 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 P26 ⑴以 融合蛋白 的形式表達(dá)藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于： （ 1）外源基因的劑量 ：一般來說細(xì)菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的表達(dá)產(chǎn)物也 增加。 ⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。 P20 基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞分為兩大類： P21 第一類為原核細(xì)胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）； ⑴大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系）：表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。 （ 2）利用 反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備基因 （ 3）化學(xué)合成法： 只適用于克隆小分子肽的基因 利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過程 P16 （ 1） mRNA 的純化 ：從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總 RNA，用寡聚脫氧胸苷（ dT）纖維素柱從總 RNA 中提取純化 mRNA。 P5 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用有哪些？ P7 （ 1）基因工程制藥：① 開發(fā)基因工程藥物，如干擾素（ IFN）、紅細(xì)胞生成素（ EPO）等 ②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 ③基因工程抗體，它可以作為導(dǎo)向藥物的載體 ④基因診斷與基因治療⑤應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 ⑥應(yīng)用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物 ⑦改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝 ⑧利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。 P1 蛋白質(zhì)工程 第二代基因工程；海洋生物技術(shù) 第三代生物技術(shù) P1 生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現(xiàn)代（ DNA 重組） P3 1974 年， Boyer 和 Cohen 建立了 DNA 重組技術(shù) 1975 年， Koher 和 Milstein 建立了單克隆抗體技術(shù) 1982 年，第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素被批準(zhǔn)上市 1989 年， 我國(guó) 第一個(gè)基因工程藥物干擾素批準(zhǔn)上市 2020 年， 中國(guó)的重組腺病毒 p53 注射液成為石階上第一個(gè)正式批準(zhǔn)的基因治療藥物。 第二節(jié) 生物技術(shù)藥物 生物技術(shù)制藥 ：生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動(dòng)物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。 （ 2）細(xì)胞工程制藥①單克隆抗體技術(shù) ②動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) ③植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物。 （ 2） cDNA 的合成 ：以 mRNA 為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一鏈，再用 DNA 聚合酶合成 cDNA 的雙鏈。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。 （ 2）外源基因的表達(dá)效率 ① 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱： 啟動(dòng)子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因表達(dá)的因素。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)； 缺點(diǎn)：只能作抗原用。 載體的復(fù)制系列可分四類： P27 （ 1） Yep 類（酵母附加體質(zhì)粒）（ 2） YRp 類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒） （ 3） YCp 類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（ 4） YIp 類（酵母整合型質(zhì)粒） 影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 ⑴外源基因的拷貝數(shù) ⑵外源基因的表達(dá)效率：①啟動(dòng)子 ②分泌信號(hào)的效 率 ③終止序列的影響 ⑶外源蛋白的糖基化 ⑷宿主菌株的影響：①菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) ②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 ③菌體性能穩(wěn)定 ④分泌能力強(qiáng) 1 精確表達(dá)載體 P28 酵母載體有兩類：普通表達(dá)載體和 精確表達(dá)載體 。 （ 7） pH 的影響：生長(zhǎng) pH在 ～ 左右，后期外源蛋白的表達(dá)其最佳 pH為 ～ 。 （ 3）目的產(chǎn)物特性。流動(dòng)相為 pH6～ 8 鹽水溶液。 (3)收率要高。 （ 2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含 50 個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結(jié)果一致。兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型 （ 2）懸浮細(xì)胞： 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。 動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) P83 （ 1）細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 動(dòng)物細(xì)胞分裂所需的時(shí)間一般為 12～ 48h，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細(xì)胞其所需的時(shí)間也不同。 (1)原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。 C； (6)空氣 :氧的飽和質(zhì) 60%,氧分壓 4～ 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成 P95 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基大致可以分成三類： 天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。 傳代方法： （ 1）懸浮細(xì)胞：加生長(zhǎng)液，然后分種 （ 2） 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ： 采用酶消化法傳代。 3．貼壁 — 懸浮培養(yǎng) ① 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，往反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。設(shè)備成本盡可能低。 P144 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 （重點(diǎn)） 克隆化：指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。 次黃嘌呤 (H)氨甲喋呤 (A)胸腺嘧啶 (T)配制。 （ 6）單克隆抗體的純化 依單抗 IgG 類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 P147 第三節(jié) 基因工程 抗體及其制備 （即鼠源性單克隆抗體的改造） 基因工程抗體： 過 PCR 技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床臨床診斷、預(yù)防、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。 Fab 抗體只有完整 IgG 的 1/3。 P158 第五節(jié) 抗體工程 抗體工程 ： 指利用重組 DNA 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，表達(dá)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等方法改造抗體分子的工程。 （ 1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素 ,如異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明（ RB200）、藻紅素（ PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。 （ 1）放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物 抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便用量小。 ③第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。 植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成 P186 （ 1）無機(jī)鹽： ①大量元素： N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na ②微量元素： Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni 等 （ 2）碳源：糖類，肌醇等；也可直接通過 光合作用吸收 CO2 （ 3） 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) P189 ①生長(zhǎng)素類 : 吲哚乙酸（ IAA）、 ②分裂素： 6芐基腺嘌呤（ 6BA） 植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)主要取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例。 （ 2）固定化培養(yǎng) 將細(xì)胞固定在固定化反應(yīng)器上（內(nèi)），放入新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及收集產(chǎn)物，因?qū)⒓?xì)胞固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體及維持細(xì)胞間物理化學(xué)梯度，易于細(xì)胞組織化，易于控制條件和獲得較高含量次級(jí)代謝產(chǎn)物。 （ 2）鼓泡塔生物反應(yīng)器：沒有運(yùn)動(dòng)部件，操作不易染菌，有較高的熱量和質(zhì)量傳遞，容易放大，但是流動(dòng)形式難以確定，混合不均。 （ 4）轉(zhuǎn)基因技術(shù) （ 5）植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥：生物轉(zhuǎn)化既可以生產(chǎn)新的化合物，又可以改造已有化合物、增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。（ 8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究。 固定化細(xì)胞的特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)各是什么？ P225 （ 1）固定化細(xì)胞： 將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。 常用的交聯(lián)劑： 戊二醛、 雙重氮聯(lián)苯胺 2二磺酸、 1,5二氟 2,4二硝基苯。此法只適用于細(xì)胞固定化。④米氏常數(shù) (Km)： Km 值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會(huì)變小。 （ 5）循環(huán)反應(yīng)器：部分反應(yīng)液流出和新加入底物流入液混合， 在進(jìn)入反應(yīng)床進(jìn)行循環(huán)。 第五節(jié) 酶的化學(xué)修飾 為什么要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾 ? P242 酶作為生物催化劑，其高 效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。 （ 2）有機(jī)相酶反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)：① 增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；② 熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng)，如酯合成、肽合成等；③ 可抑制有水參與的副反應(yīng)；④ 酶不溶于有機(jī)介質(zhì)，易于回收再利用；⑤ 容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物； ⑥ 酶的熱穩(wěn)定性提高， pH 的適應(yīng)性擴(kuò)大；⑦ 無微生物污染；⑧ 能測(cè)定某些在水介質(zhì)中不能測(cè)定的 常數(shù)；⑨ 固定化酶方法簡(jiǎn)單，可以只沉淀在載體表面。 核酶：（ 1）剪切性核酶：錘頭型核酶、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒（ HDV）核酶、蛋白質(zhì) RNA復(fù)合酶（ RNaseP）（ 2）剪接型核酶：Ⅰ內(nèi)含子、Ⅱ內(nèi)含子 ； P250 抗體酶： 一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。 過程：（ 1）標(biāo)記菌株（細(xì)胞）：通過誘變使菌株（細(xì)胞）具備遺傳標(biāo)記（如：營(yíng)養(yǎng)缺陷）以便篩選 （ 2）制備原生質(zhì)體： 將兩親株分別用酶 （ 細(xì)菌用溶菌酶，酵母菌和霉菌用蝸牛酶或纖維素酶 ） 處理，使細(xì)胞壁全部消化或使 之 破裂，原生質(zhì)體即可從細(xì)胞內(nèi)逸出。一般 保藏菌種→斜面培養(yǎng)（活化）→搖瓶培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐，以便得到足 夠數(shù)量和質(zhì)量的純種。 （ 3）補(bǔ)料分批發(fā)酵 ①定義 ：補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 缺點(diǎn) ：存在一定的非生產(chǎn)時(shí)間；和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險(xiǎn)。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及 控制 pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 （ 3） 原生質(zhì)體融合和再生 ： 制備好的二親本原生質(zhì)體可通過化學(xué)因子 （ PEG） 誘導(dǎo)或電場(chǎng)誘導(dǎo)進(jìn)行融合。 P252 第七章 發(fā)酵工程制藥 第一節(jié) 概述 發(fā)酵工程：微生物工程，利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務(wù)的技術(shù)。 （ 1）水 — 水溶性溶劑均相體系：由水和水溶性有機(jī)溶劑相互溶解而形成的均一體系。工業(yè)用酶常常由于酶蛋白抗酸、堿、有機(jī)溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制，工業(yè)反應(yīng)要求的 pH 和溫度不總在酶反應(yīng)的最適 pH 和最適溫度范圍內(nèi)，底物不溶于水或酶的 Km 值過高等弱點(diǎn)，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。它們一般具有高效和高適應(yīng)性的特點(diǎn)，在結(jié)構(gòu)上相對(duì)天然酶簡(jiǎn)單。 固定化酶活力測(cè)定方法：分批測(cè)定法和連續(xù)測(cè)定法。 （ 2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對(duì)溫度、 pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。 （ 3）優(yōu)點(diǎn)： ①無須進(jìn)行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高；③比固定化酶穩(wěn)定性高；④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生；⑤細(xì)胞本身含多酶體系；⑥抗污染能力強(qiáng) 缺點(diǎn)：①副產(chǎn)物多②細(xì)胞的壁、膜和載體都存在擴(kuò)散限制作用③載體 的空隙大小影響高分子底物的通透性 酶和細(xì)胞的固定化方法 P220 （ 1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法 ①物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體（如活性炭等）上的固定化方法。 P217 應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌： 大腸桿菌、枯草桿菌 、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黃曲霉）。 P216 酶工程主要研究?jī)?nèi)容是什么？ P216 （ 1）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶的應(yīng)用開發(fā)。 （ 4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器：比較適合高密度培養(yǎng)，但是難于大規(guī)模操作，放大困難。 （二）培養(yǎng)條件的影響 （ 1）內(nèi)在因素 ① 接種和誘導(dǎo)：次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外肢體的大小、細(xì)胞密度與營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān) ② 培養(yǎng)基的基本組成：培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是穩(wěn)定期的次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。 （植物激素：指植物代謝過程中形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（ 1M）時(shí)即能調(diào)節(jié)植 物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。 （ 3）免疫毒素的臨床應(yīng)用 治療腫瘤、自身免疫病，并能克復(fù)組織移植排斥反應(yīng)，可單獨(dú)給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它微粒中給藥。 （ 2）抗癌藥物偶 聯(lián)的抗體藥物 ①常用的抗癌藥物 氨甲喋呤（ MTX）、阿霉素（ ADM）、絲裂霉素（ MMC）等。 （ 2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標(biāo)診斷試劑 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原 )酶標(biāo)診斷試劑 b、 HBeAg(乙型肝炎 e 抗原 )酶標(biāo)診斷試劑 c、 HAVAg(甲型肝炎病毒抗原 )酶標(biāo)診斷試劑 d、測(cè)定 HIV（人免疫缺陷