【正文】 無機鹽的存在能使相互作用力增強。 （ 2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。 （ 3）連續(xù)培養(yǎng) （ 4）透析培養(yǎng) （ 5）固定化培養(yǎng) 基因工程菌的培養(yǎng)工藝 P37 （ 1） 培養(yǎng)基的影響（ 2） 接種量的影響（ 3） 溫度的影響（ 4）溶氧量的影響（ 5）誘導時機的影響（ 6）誘導表達程序的影響： 一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導表達。 穿梭載體： 指含有兩個親緣關(guān)系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的 載體（ 例如既能在原核生物中復制 ,又能在真核生物中復制的載體 ）。 真核基因在大腸桿菌中的表達形式 P26 ⑴以 融合蛋白 的形式表達藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。單個細胞產(chǎn)量取決于： （ 1）外源基因的劑量 ：一般來說細菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的表達產(chǎn)物也 增加。 ⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達受到重視。 P20 基因表達的微生物宿主細胞分為兩大類： P21 第一類為原核細胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）； ⑴大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系）：表達基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。 （ 2）利用 反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈式反應制備基因 （ 3）化學合成法： 只適用于克隆小分子肽的基因 利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過程 P16 （ 1） mRNA 的純化 ：從表達目的基因的細胞中提取總 RNA，用寡聚脫氧胸苷（ dT）纖維素柱從總 RNA 中提取純化 mRNA。 P5 生物技術(shù)在制藥中的應用有哪些？ P7 （ 1）基因工程制藥：① 開發(fā)基因工程藥物，如干擾素（ IFN）、紅細胞生成素（ EPO）等 ②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 ③基因工程抗體，它可以作為導向藥物的載體 ④基因診斷與基因治療⑤應用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 ⑥應用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物 ⑦改進藥物生產(chǎn)工藝 ⑧利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。 P1 蛋白質(zhì)工程 第二代基因工程；海洋生物技術(shù) 第三代生物技術(shù) P1 生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現(xiàn)代（ DNA 重組） P3 1974 年， Boyer 和 Cohen 建立了 DNA 重組技術(shù) 1975 年， Koher 和 Milstein 建立了單克隆抗體技術(shù) 1982 年，第一個基因工程藥物重組人胰島素被批準上市 1989 年， 我國 第一個基因工程藥物干擾素批準上市 2020 年， 中國的重組腺病毒 p53 注射液成為石階上第一個正式批準的基因治療藥物。 第二節(jié) 生物技術(shù)藥物 生物技術(shù)制藥 ：生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。 （ 2）細胞工程制藥①單克隆抗體技術(shù) ②動物細胞培養(yǎng) ③植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物。 （ 2） cDNA 的合成 ：以 mRNA 為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一鏈，再用 DNA 聚合酶合成 cDNA 的雙鏈。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達產(chǎn)物需經(jīng)變性復性才恢復活性。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產(chǎn)物可糖基化。 （ 2）外源基因的表達效率 ① 啟動子的強弱： 啟動子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因表達的因素。 優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達； 缺點：只能作抗原用。 載體的復制系列可分四類： P27 （ 1） Yep 類（酵母附加體質(zhì)粒）（ 2） YRp 類（酵母復制型質(zhì)粒） （ 3） YCp 類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（ 4） YIp 類（酵母整合型質(zhì)粒） 影響目的基因在酵母菌中表達的因素 ⑴外源基因的拷貝數(shù) ⑵外源基因的表達效率：①啟動子 ②分泌信號的效 率 ③終止序列的影響 ⑶外源蛋白的糖基化 ⑷宿主菌株的影響：①菌體生長力強 ②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 ③菌體性能穩(wěn)定 ④分泌能力強 1 精確表達載體 P28 酵母載體有兩類：普通表達載體和 精確表達載體 。 （ 7） pH 的影響：生長 pH在 ～ 左右，后期外源蛋白的表達其最佳 pH為 ～ 。 （ 3）目的產(chǎn)物特性。流動相為 pH6～ 8 鹽水溶液。 (3)收率要高。 （ 2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含 50 個左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結(jié)果一致。兩種形態(tài)： 成纖維細胞型和上皮細胞型 （ 2）懸浮細胞： 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。 動物細胞的生理特點 P83 （ 1）細胞的分裂周期長 動物細胞分裂所需的時間一般為 12～ 48h，它不僅隨細胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細胞其所需的時間也不同。 (1)原代細胞 原代細胞是直接取自動物組織、器官，經(jīng)過分碎，消化而獲得的細胞懸液。 C； (6)空氣 :氧的飽和質(zhì) 60%,氧分壓 4～ 培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基的種類和組成 P95 動物細胞培養(yǎng)基大致可以分成三類： 天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。 傳代方法： （ 1）懸浮細胞：加生長液，然后分種 （ 2） 貼壁生長細胞傳代 ： 采用酶消化法傳代。 3．貼壁 — 懸浮培養(yǎng) ① 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。另一種是先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，往反應器內(nèi)加入誘導劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反應物取出。設備成本盡可能低。 P144 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 （重點） 克隆化：指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。 次黃嘌呤 (H)氨甲喋呤 (A)胸腺嘧啶 (T)配制。 （ 6）單克隆抗體的純化 依單抗 IgG 類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 P147 第三節(jié) 基因工程 抗體及其制備 （即鼠源性單克隆抗體的改造） 基因工程抗體： 過 PCR 技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應用于疾病的臨床臨床診斷、預防、治療及基礎理論研究等領(lǐng)域。 Fab 抗體只有完整 IgG 的 1/3。 P158 第五節(jié) 抗體工程 抗體工程 ： 指利用重組 DNA 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對抗體基因進行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當?shù)氖荏w細胞后，表達抗體分子，或用細胞融合、化學修飾等方法改造抗體分子的工程。 （ 1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素 ,如異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明（ RB200）、藻紅素（ PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。 （ 1）放射性核素標記的抗體治療藥物 抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便用量小。 ③第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達。 植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成 P186 （ 1）無機鹽： ①大量元素： N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na ②微量元素： Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni 等 （ 2）碳源：糖類，肌醇等；也可直接通過 光合作用吸收 CO2 （ 3） 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) P189 ①生長素類 : 吲哚乙酸（ IAA）、 ②分裂素： 6芐基腺嘌呤（ 6BA） 植物組織和細胞培養(yǎng)物的生長主要取決于生長素和分裂素的比例。 （ 2）固定化培養(yǎng) 將細胞固定在固定化反應器上（內(nèi)），放入新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基，進行連續(xù)培養(yǎng)及收集產(chǎn)物，因?qū)⒓毎潭?，易于獲得高密度細胞群體及維持細胞間物理化學梯度，易于細胞組織化，易于控制條件和獲得較高含量次級代謝產(chǎn)物。 （ 2）鼓泡塔生物反應器：沒有運動部件，操作不易染菌，有較高的熱量和質(zhì)量傳遞，容易放大，但是流動形式難以確定，混合不均。 （ 4）轉(zhuǎn)基因技術(shù) （ 5）植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥：生物轉(zhuǎn)化既可以生產(chǎn)新的化合物，又可以改造已有化合物、增加目標產(chǎn)物產(chǎn)量。（ 8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成的研究。 固定化細胞的特點和優(yōu)缺點各是什么？ P225 （ 1）固定化細胞： 將細胞限制或定位于特定空間位置的方法。 常用的交聯(lián)劑： 戊二醛、 雙重氮聯(lián)苯胺 2二磺酸、 1,5二氟 2,4二硝基苯。此法只適用于細胞固定化。④米氏常數(shù) (Km)： Km 值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。 （ 5）循環(huán)反應器：部分反應液流出和新加入底物流入液混合， 在進入反應床進行循環(huán)。 第五節(jié) 酶的化學修飾 為什么要對酶進行化學修飾 ? P242 酶作為生物催化劑，其高 效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。 （ 2）有機相酶反應的優(yōu)點：① 增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；② 熱力學平衡向合成方向移動，如酯合成、肽合成等；③ 可抑制有水參與的副反應；④ 酶不溶于有機介質(zhì)，易于回收再利用；⑤ 容易從低沸點的溶劑中分離純化產(chǎn)物； ⑥ 酶的熱穩(wěn)定性提高， pH 的適應性擴大；⑦ 無微生物污染；⑧ 能測定某些在水介質(zhì)中不能測定的 常數(shù)；⑨ 固定化酶方法簡單，可以只沉淀在載體表面。 核酶：（ 1）剪切性核酶：錘頭型核酶、發(fā)夾型、丁型肝炎病毒（ HDV）核酶、蛋白質(zhì) RNA復合酶（ RNaseP）（ 2）剪接型核酶：Ⅰ內(nèi)含子、Ⅱ內(nèi)含子 ； P250 抗體酶： 一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。 過程：（ 1）標記菌株（細胞）：通過誘變使菌株（細胞）具備遺傳標記（如：營養(yǎng)缺陷）以便篩選 （ 2）制備原生質(zhì)體： 將兩親株分別用酶 （ 細菌用溶菌酶，酵母菌和霉菌用蝸牛酶或纖維素酶 ） 處理，使細胞壁全部消化或使 之 破裂，原生質(zhì)體即可從細胞內(nèi)逸出。一般 保藏菌種→斜面培養(yǎng)（活化）→搖瓶培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐，以便得到足 夠數(shù)量和質(zhì)量的純種。 （ 3）補料分批發(fā)酵 ①定義 ：補料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 缺點 ：存在一定的非生產(chǎn)時間；和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及 控制 pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 （ 3） 原生質(zhì)體融合和再生 ： 制備好的二親本原生質(zhì)體可通過化學因子 （ PEG） 誘導或電場誘導進行融合。 P252 第七章 發(fā)酵工程制藥 第一節(jié) 概述 發(fā)酵工程：微生物工程，利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務的技術(shù)。 （ 1）水 — 水溶性溶劑均相體系：由水和水溶性有機溶劑相互溶解而形成的均一體系。工業(yè)用酶常常由于酶蛋白抗酸、堿、有機溶劑變性及抗熱失活能力差，容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制，工業(yè)反應要求的 pH 和溫度不總在酶反應的最適 pH 和最適溫度范圍內(nèi)，底物不溶于水或酶的 Km 值過高等弱點，限制了酶制劑的應用范圍。它們一般具有高效和高適應性的特點，在結(jié)構(gòu)上相對天然酶簡單。 固定化酶活力測定方法：分批測定法和連續(xù)測定法。 （ 2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、 pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。 （ 3）優(yōu)點： ①無須進行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高；③比固定化酶穩(wěn)定性高；④細胞內(nèi)酶附助因子可再生；⑤細胞本身含多酶體系；⑥抗污染能力強 缺點：①副產(chǎn)物多②細胞的壁、膜和載體都存在擴散限制作用③載體 的空隙大小影響高分子底物的通透性 酶和細胞的固定化方法 P220 （ 1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法 ①物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體（如活性炭等）上的固定化方法。 P217 應用最廣泛的產(chǎn)酶菌： 大腸桿菌、枯草桿菌 、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黃曲霉）。 P216 酶工程主要研究內(nèi)容是什么？ P216 （ 1）酶的分離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶的應用開發(fā)。 （ 4）轉(zhuǎn)鼓式生物反應器：比較適合高密度培養(yǎng)，但是難于大規(guī)模操作，放大困難。 （二）培養(yǎng)條件的影響 （ 1）內(nèi)在因素 ① 接種和誘導：次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外肢體的大小、細胞密度與營養(yǎng)成分相關(guān) ② 培養(yǎng)基的基本組成：培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞的物質(zhì)基礎，尤其是穩(wěn)定期的次級代謝產(chǎn)物的積累。 （植物激素：指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（ 1M）時即能調(diào)節(jié)植 物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。 （ 3）免疫毒素的臨床應用 治療腫瘤、自身免疫病，并能克復組織移植排斥反應，可單獨給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它微粒中給藥。 （ 2）抗癌藥物偶 聯(lián)的抗體藥物 ①常用的抗癌藥物 氨甲喋呤（ MTX）、阿霉素（ ADM）、絲裂霉素（ MMC）等。 （ 2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標診斷試劑 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原 )酶標診斷試劑 b、 HBeAg(乙型肝炎 e 抗原 )酶標診斷試劑 c、 HAVAg(甲型肝炎病毒抗原 )酶標診斷試劑 d、測定 HIV（人免疫缺陷