【正文】 過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的有機(jī)體。 接頭： 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 ： SV40DNA 為載體的取代克隆方式分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。能自主復(fù)制 。當(dāng)利用單鏈核酸酶 S，酶去除解開的單鏈部分，得到富 G≡ C 區(qū)的 DNA 片段 。 上接頭的加入 。 人 的 β 珠蛋白，必須經(jīng)過幾個基本步驟 (參考填空題 3 題 ) 獲得目的基因序列（過程，方法） —— 設(shè)計(jì)引物 —— （ PCR 擴(kuò)增，文庫法， cDNA） —— 選擇載體 —— 宿主 —— 篩選 —— 發(fā)酵培養(yǎng) —— 分離純化。 固定化酶活力下降為原初活力一半時所經(jīng)歷的連續(xù)操作時間稱為其操作半衰期，其長短顯示出固定化酶操作穩(wěn)定性的高低 固定化反應(yīng)過程中 載體結(jié)合蛋白質(zhì)的能力稱為偶聯(lián)效率 偶聯(lián)效率（ %） =（加入的總酶蛋白量－上清液殘留總蛋白量） /加入的總酶蛋白量 100% 偶聯(lián)效率（ %） =（加入的總酶活力－上清液殘留總酶活力） /加入的總活力 100% 收率 偶聯(lián)反應(yīng)后，固定化酶所顯示的活力與加入偶聯(lián)液中酶的總活力的比值 活力回收率（ %） =固定化酶總活力 /加入偶聯(lián)液總酶活力 100% 已被固定化的酶的活力與同樣蛋白質(zhì)量的天然酶活力的比值 相對活力（ %） =固定化酶總活力 /（加入酶總活力－上清液中未偶聯(lián)酶總活力） 100% 以酶（游離酶或固定化酶）作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)所需的設(shè)備 在分子水平上對酶進(jìn)行改造，即在體外將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的酶學(xué) 性質(zhì)的技術(shù)。 （ 6）轉(zhuǎn)化反 應(yīng)基本無三廢排出，因此稱之為 ―無公害酶 ‖ ，固定化細(xì)胞具有哪些優(yōu)點(diǎn)？ （ 1）無需進(jìn)行酶的分離純化、減少起始投資； （ 2）細(xì)胞保持原初生命活動狀態(tài)，固定化過程酶回收率高； （ 3）細(xì)胞內(nèi)酶較固定化酶穩(wěn)定性更高； （ 4）細(xì)胞內(nèi)輔因子可以自動再生； （ 5）細(xì)胞本身含多酶體系，可催化一系列反應(yīng)； （ 6）抗污染能力強(qiáng)。泡沫過多時，影響更為嚴(yán)重，可能會造成大量逃液，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機(jī)會等，嚴(yán)重時通氣攪拌也無法進(jìn)行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異常或菌體自溶 消沫方法： 機(jī)械消沫 、 消沫劑消沫 ？ 碳源、氮源、無機(jī)鹽、 微量元素、 水 、前體、生長因子和發(fā)酵物刺激物等 成物質(zhì)來源可分為哪兩種，各自具有什么特點(diǎn)？ ① 合成培養(yǎng)基： 所用原料的化學(xué)成分明確、穩(wěn)定，但營養(yǎng)單一且價(jià)格昂貴，用這種培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好、低泡、呈半透明，適用于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。這類化合物的平面三環(huán)結(jié)構(gòu)可插入 DNA 雙螺旋的鄰近堿基對之間，造成 DNA鏈上堿基的添加或缺失，從而造成堿基突變點(diǎn)后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤，引起菌種變異。分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。 細(xì)胞融合的促融因素 ① 生物促融劑：病毒 ② 化學(xué)促融劑： PEG、溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿 ③ 物理促融劑：電場力、離心力、激光 細(xì)胞融合及遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移方式有哪些？ ； ，胞質(zhì)體與完整細(xì)胞融合作用； ； 。（參考上一題） 什么叫 McAb？基本特征是什么？ McAb：由一個雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞株（或克隆系）產(chǎn)生的抗一種抗原決定簇的抗體。 如 PBS，配培養(yǎng)基和洗材料用。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 17 1飼養(yǎng)細(xì)胞（滋養(yǎng)細(xì)胞）： 在細(xì)胞培養(yǎng)中，加入的活細(xì)胞（如小鼠胸腺細(xì)胞或腹腔細(xì)胞）能促進(jìn)單個或少數(shù)分散細(xì)胞的生長增殖，其本身無分裂能力，克隆形成后，自身死亡。 （ 2）堿基類似物： 它們能夠摻入到 DNA 分子中而引起遺傳變異 。 加熱滅菌法 、 輻射滅菌法 、 介質(zhì)過濾除菌法 、 和 化學(xué)滅菌法 。 ③ 交聯(lián)法 ： 采用雙功能或多功能試劑使酶分子內(nèi)或分子間彼此連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而使酶固定化的技術(shù)。 技術(shù)： 是指在四種脫氧核苷三磷酸（ dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA 為模板，經(jīng) DNA 聚合酶催化，合成 DNA 互補(bǔ)鏈達(dá)到基因擴(kuò)增目的的過程。 序列上終止密碼的選擇 : ①首選 UAA。 . 文庫的建立有哪些步驟 ? 。 ，主要表達(dá)方式 非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)；融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)；分泌表達(dá)。因此， IPTG 被稱為β半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。 條件：只要目的基因在宿主中表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)，并能獲得相應(yīng)抗體，即可用本技術(shù)檢測相應(yīng) DNA。其目的是為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。 (somatic embryo)： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。 三、填空題： 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式主要有：分批培養(yǎng)法 ，連續(xù)培養(yǎng)法，半連續(xù)培養(yǎng)法和固定化培生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 2 養(yǎng)法 誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合的因素主要有： PEG 誘導(dǎo)； NaNO3 誘導(dǎo)；高鈣和高 PH誘導(dǎo)；高鈣和高 PH 及 PEG 結(jié)合誘導(dǎo) 一般認(rèn)為形成的器官的類型受培養(yǎng)基中兩類激素的相對濃度的控制，較高濃度的 生長素 有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，較高濃度的 細(xì)胞分裂素 則促進(jìn)芽的形成而抑制根的形成。 細(xì)胞分化： 是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功 能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture)： 將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。特點(diǎn)：效果好，易于成功；簡便易行；不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長過程； ④ 微室培養(yǎng) ： 人工制造一個小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。在洗脫過程中， PEG 將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。 ： 指多個限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。獲得具有新遺傳性狀的生物細(xì)胞的過程。 基本步驟 ①獲得目的基因 ； ②在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子上，形成重組 DNA 分子；③將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖；④從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組 DNA 分子的宿主細(xì)胞克隆；⑤從這些篩選出來的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò) 增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 ④ 基因組文庫法 :從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。 的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)： ①利用 RNase 缺失的受體菌 。 （ 克服的方法是將 5?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的 5‘OH所取代。 三、 問答題 ？什么是酶工程？ 酶具有以下特性： 酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。 此法可以避免酶反應(yīng)過程的底物抑制現(xiàn)象 ③ 連續(xù)式反應(yīng)器： 一邊連續(xù)地將底物溶液加入反應(yīng)器中，一邊連續(xù)地使反應(yīng)液以相同流量排出反應(yīng)器 。 ？相應(yīng)的分離方法有哪些？ 下游加工過程分為 ： 發(fā)酵液的預(yù)處理 、 初步純化 、 高度純化（精制） 、 成品加工 單元操作 :絮凝、固 液分離、細(xì)胞破碎、沉淀、吸附、膜分離、萃取、離子交換、電泳、結(jié)晶、色譜分離、濃縮、干燥、包裝等 ① 標(biāo)記菌株的篩選 ：兩株親本必須帶有不同的遺傳標(biāo)記 ② 原生質(zhì)體的制備 ：細(xì)菌放線菌 —— 溶菌酶；酵母菌霉菌 —— 蝸牛酶、纖維素酶 菌體需先經(jīng)過預(yù)處理；選擇對數(shù)生長期后期的菌體；選擇合適的酶濃度、酵解時間、酵 解溫度（ 20~40℃ ）；添加滲透壓穩(wěn)定劑 ③ 原生質(zhì)體的融合： PEG 和 Ca2+ ④ 原生質(zhì)體的再生 ：必須使用再生培養(yǎng)基 ⑤ 融合子的選擇 ，加入滲透壓穩(wěn)定劑的作用是什么，常用的穩(wěn)定劑有哪些？ 原生質(zhì)體對溶液和培養(yǎng)基的滲透壓很敏感，必須在高滲或等滲透壓的溶液或培養(yǎng)基中才能維持其生存，低滲透壓溶液中，原生質(zhì)體將會破裂而死亡。 接觸抑制性： 當(dāng)細(xì)胞長滿于附著物表面，相鄰的細(xì)胞表面間相互接觸，使細(xì)胞對數(shù)生長期停止進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞生長大大減慢，細(xì)胞生長，死亡處于動態(tài)平衡。（第二代單克隆抗體） 1 McAb： 由一個雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞株（或克隆系）產(chǎn)生的抗一種抗原決定簇的抗體。 DMSO 能溶解藍(lán)紫色物，顏色深淺與所含藍(lán)紫色物量成正比 細(xì)胞克隆培養(yǎng)及優(yōu)點(diǎn) 定義： 把一個單細(xì)胞從一個群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成為一個新的細(xì)胞群體的 培養(yǎng)技術(shù)。再通過篩選和克隆化培養(yǎng)生產(chǎn)某種預(yù)定性質(zhì)的單克隆抗體，又可在體外無限增值 HAT 篩選： （ 1） HAT 是含一定濃度次黃嘌呤 H，氨基喋呤 A 及胸腺嘧啶核苷 T 的一種選擇性培養(yǎng)基。此抗體可明顯降低由鼠源單克隆抗體所致的人抗鼠抗體反應(yīng) 2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)： 外源目的基因?qū)氩溉閯游锏氖芫鸦蚺咛ィ康幕蚺c染色體 DNA 整合；細(xì)胞分裂時，該目的基因隨染色體的倍增而倍增，使每個細(xì)胞都帶有 目的基因，在 體內(nèi)能表達(dá)，且能穩(wěn)定地遺傳到下一代。 傳代培養(yǎng) （移植繼代培養(yǎng)） ： 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互接近匯合時，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶經(jīng)消化，收集，稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程。另外，PEG 的脫水作用，擾亂了分散在原生質(zhì)膜表面的蛋白質(zhì)和脂類的排列，提高了脂類膠粒的流動性，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體融合。 某些 微生物生長所必需的有機(jī)物質(zhì)，但其需要量不大，通常把這些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)稱為生長因子 。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時實(shí)現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。 ） ？ ① 分離純化需改造的目的蛋白； ② 了解其一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)，了解其結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系； ③獲 取編碼該蛋白的基因序列； ④ 設(shè)計(jì)改造方案； ⑤ 對基因序列進(jìn)行改造； ⑥ 將經(jīng)過改造的基因序列重組入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)；⑦分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對其功能進(jìn)行檢測。 : ①首選 AUG 為起始密碼子；②正確的 SD 序列；③ SD序列與起始密碼子之間的距離以 9177。 。 ① 有效的轉(zhuǎn)錄起始； ② mRNA 的穩(wěn)定性； ③ 有效地翻譯啟始； ④ 遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性； ⑤ mRNA 的加工； ⑥ mRNA 序列上終止密碼的選