【正文】 酶與底物易于分開，并可長期反復(fù)使用 （ 3）反應(yīng)液中無殘留酶，產(chǎn)物易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高 （ 4）可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)連續(xù)化和自動化控制； （ 5）酶的利用效率高，產(chǎn)品成本低。 缺點(diǎn)： 載體需活化，固定化操作復(fù)雜，反應(yīng) 條件較劇烈，酶易失活并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。 誘導(dǎo)法 、 引入法 、 拷貝法 和 抗體庫法 。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 9 酶工程 一、 專業(yè)符號及名詞解釋 1. NADPH 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE 二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP 二硝基苯酚 4. error prone PCR 易錯 PCR 5. DNA shuffling DNA 改組 6. IU 酶活力國際單位 7. Katal 酶活力單位 8. 酶工程 指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù) 9. 酶的活力單位 酶在最適條件下，單位時間內(nèi)，酶催化底物的減少量或產(chǎn)物的生成量 （ IU：指在特定條件下， 1min 內(nèi)生成 1μ mol 產(chǎn)物的酶量） 每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù) 酶的比活力 =酶活力單位數(shù) /毫克酶蛋白 （ Immobilized enzyme） 通過物理和化學(xué)的方法將酶束縛在一定空間內(nèi)且仍具有催化活性的酶 制劑 （ Immobilized cell） 指被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞，與固定化酶一起統(tǒng)稱為固定化生物催化劑。 ：① 隨機(jī)酶切成較大的 DNA 片段（ 10~30Kb，平均 20Kb)，對這些片段進(jìn)行分離； ② 重組入適當(dāng)載體（噬菌體）； ③ 轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌（ )，擴(kuò)增，構(gòu)建成基因文庫；④ 從基因組文庫中篩選出含有目的基因組的重組子。 ） ？ ① 分離純化需改造的目的蛋白； ② 了解其一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)，了解其結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系； ③獲 取編碼該蛋白的基因序列； ④ 設(shè)計改造方案； ⑤ 對基因序列進(jìn)行改造； ⑥ 將經(jīng)過改造的基因序列重組入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)；⑦分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對其功能進(jìn)行檢測。 C. DNA 接頭連接法 ：優(yōu)點(diǎn)： 一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 : ①通過組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；②產(chǎn)生可分泌的蛋白質(zhì)；③以包含體的形式表達(dá)；④選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。但許多哺乳動物類細(xì)胞中外源基因的表達(dá)需要內(nèi)含子存在，如果在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)外源基因時，最好用基因組基因而非cDNA。 : ①首選 AUG 為起始密碼子；②正確的 SD 序列；③ SD序列與起始密碼子之間的距離以 9177。 命名原則：屬 —— 種 —— 株 —— 分離序號 例如： EcoRⅠ 屬： Escherichia 種： coli 株： R 分離序號：Ⅰ 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二，第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 cDNA 鏈的合成 。 。 。 ③ cDNA 文庫的建立與基因的分離 :是以 mRNA 為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) DNA 的方法。 通過控制溶解溫度使富 A=T 區(qū)解鏈變性，而富 G≡ C 區(qū)仍維持雙鏈。 : ① 有很高的拷貝數(shù)； ② 強(qiáng)大的啟動子，可保證外源基因的高效表達(dá)； ③ 可保證糖基化。 ① 有效的轉(zhuǎn)錄起始； ② mRNA 的穩(wěn)定性； ③ 有效地翻譯啟始； ④ 遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性； ⑤ mRNA 的加工； ⑥ mRNA 序列上終止密碼的選擇；⑦表達(dá)質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性；⑧外源基因的穩(wěn)定性。小不同的外源性目的基因、載體分子量要小 ,載力要大 。 : DNA蛋白質(zhì)篩選法是用來專門檢測同 DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的中的外源 DNA編碼一種能專門同某一特定 DNA 序列結(jié)合的 DNA 結(jié)合蛋白質(zhì) . 三、 填空題 : 。 IPTG 是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。 ： 位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對 稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。 ： 所謂基因組文庫是將基因組 DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組 DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組 DNA 的所有序列。 : 根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養(yǎng)板上重組 轉(zhuǎn) 化體菌落位置的技術(shù)稱之為原位雜交技術(shù)。 : 利用抗原 抗體反應(yīng)來檢測含目的基因的重組轉(zhuǎn)化體或嗜斑的技術(shù)稱為免疫分析法。 ： 識別順序與切割方式均相同者，為之同裂酶。 ） ： 與同裂酶對應(yīng)的一類限制酶，它們雖來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱為同尾酶。長度一般 1040 個殘基。 ： 是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。 優(yōu)點(diǎn)： 是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 植物細(xì)胞融合過程如何？融合特點(diǎn)是什么？ 融合過程： ①凝聚作用階段，其間兩個或兩個以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； ②在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋； ③由于細(xì)胞質(zhì) 橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。 2)胚狀體形成 ： 在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子進(jìn)一步發(fā)育成胚。 （由莖尖、腋芽、生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 3 原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生） （ 2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。特點(diǎn)：能在顯微鏡下追蹤單細(xì)胞分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的全過程；培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持， pH 值變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。特點(diǎn)：可以定點(diǎn)觀察；分離單細(xì)胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢； ③ 看護(hù)培養(yǎng) ： 指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。用途：主要用來增殖細(xì)胞。 1植物細(xì)胞脫分化 ： 離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過程。有兩種發(fā)生方式：（ 1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。 綠島法 ： 在植株上使葉面細(xì)胞產(chǎn)生突變并創(chuàng)造選擇壓力，令抗性突變細(xì)胞正常生長形成綠色斑點(diǎn)，謂之“綠島”，其為突變細(xì)胞，分散和培養(yǎng)后可得完整植株 植物原生質(zhì)體 ： 除去纖維素外壁且具有生活力的裸體植物細(xì)胞 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑 ： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。 看護(hù)培養(yǎng)法 ： 用一塊愈傷 組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法。 細(xì)胞平板培養(yǎng)： 將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法 器官發(fā)生途徑 ： 離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。在 TDNA 區(qū)和 Vir 區(qū)基因的協(xié)同作用下，農(nóng)桿菌完成侵染植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)移 TDNA 的過程。細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑 (葡萄糖硫酸鉀、 MES、 CaCl?2H2O、 KH2PO4 等 ). 植物原生質(zhì)體制備需要的酶：纖維素酶和果膠酶 常用的生長素有 _ 吲哚乙酸 ___、 _萘乙酸 ___、 _2,4D__ 、 _吲哚丁酸 __等，常用的細(xì)胞分裂素 __激動素 __ 、 __6芐基氨基嘌呤 __、 _玉米素 _ 由愈傷組織再生植株有兩條途徑： 一步成苗 （ 原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗 ）和 兩步法成苗 （ 即首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗 ） 四、 問答題 植物細(xì)胞實驗室培養(yǎng)方法有哪幾種？ ① 液體淺層培養(yǎng)法 ： 將懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞過濾得到游離單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)在淺層液體培養(yǎng)基中。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。用途：主要用來觀察細(xì)胞生長、分裂、形成 細(xì)胞團(tuán)的過程。 （ 1）直接發(fā)生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。這一階段同不定芽方式一樣。 3)胚狀體再發(fā)育成完整植株 ： 在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 4 基因工程 一． 專業(yè)符號 Tetr 四環(huán)素抗性 R/M 體系 限制與修飾現(xiàn)象 Ampr 氨芐青霉素抗性 pBR322 質(zhì)粒載體 M13 單鏈 DNA 噬菌體載體 cosmid 科斯質(zhì)粒 IPTG 異丙基 β D 硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA 連接酶 EcoRI 限制性 酶 切位點(diǎn) host 宿主 Plasmid 質(zhì)粒 Ori 復(fù)制起始位點(diǎn) vector 載體 cDNA 反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ) DNA southern blot DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù) MCS 多克隆位點(diǎn) 二． 名詞解釋 bioengineering ： 利用生物有機(jī)體（包括微生物和動、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器）和組織成分（包括 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、酶、多糖 、抗體等），形成新的技術(shù)手段來發(fā)展新產(chǎn)品和新工藝的一種技術(shù)體系。如果在目的基因兩側(cè)加 polydA，則在載體兩側(cè)加 polydT。 （ 作用：一是保護(hù)自身的 DNA不受限制，二是破壞外源 DNA 使之迅速降解。由許多限制酶切點(diǎn)組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的 DNA 序列。