【正文】 : 是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、晶體學(xué)和動力學(xué)的研究，獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上，對編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的的改造，并 通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終得到比天然蛋白質(zhì)更好的產(chǎn)物。 基因工程中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組 DNA 分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細(xì)胞稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。 ： 是指用化學(xué)方法合成的一段由 1012 個核 苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。 基因工程操作中的轉(zhuǎn)化是泛指將重組 DNA 轉(zhuǎn)入宿主中的方法。這些阻遏物的存在可以抑制 Lac 操縱子的表達(dá)。 當(dāng)它 的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新 的DNA 分子，而易于連接重組。裝卸手續(xù)簡單 。 表達(dá)系統(tǒng)中常用的強(qiáng)啟動子 Lac Trp λ PL λ PR 基因制備方法 ①基因分離的物理方法 ； ②鳥槍法；③ cDNA 文庫的建立與基因分離；④基因組文庫法；⑤基因的化學(xué)合成；⑥聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（ PCR）。 片段的連接方法 平頭 雙鏈 DNA 分子的連接（ T4DNA 連接酶）；粘性末端 DNA 片段的連接（ DNA 連接酶）；平末端 DNA 片段的連接（同聚物加尾法，銜接物連接法， DNA 接頭連接法）。如 DNA 分子中某段的 G≡ C 堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（ Tm）就高。：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。 ⑤ 基因的化學(xué)合成 :優(yōu)點(diǎn) : 。 ⑥ 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（ PCR） :優(yōu)點(diǎn)： 。 cDNA鏈的合成 。多的重組體中篩選出特定的基因 . 名原則是什么 ? 凡能識別并切割雙螺旋 DNA 分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。② mRNA的 5′ 端與 3′ 端的正確加工，提高 mRNA 的穩(wěn)定性 。 的加工與基因高效表達(dá) :絕大多數(shù)較高等的真核基因含有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在 mRNA的加工過程中，在細(xì)胞核中被加工去除而產(chǎn)生成熟的 mRNA。 :一般來講：①質(zhì)粒拷 貝數(shù)多，基因表達(dá)水平高；②表達(dá)質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性與基因高效表達(dá) 。無法控制外源基因插入方向 ； B. 銜接物 連接法 :優(yōu)點(diǎn) ：克隆后還可回收原插入片斷 ； 缺點(diǎn) ： 如果待克隆的 DNA 片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補(bǔ)堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在 5?OH和 3‘ –OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。 ：①目的抗原基因的選擇和獲得（構(gòu)建 cDNA 文庫， PCR 擴(kuò)增，人工合成）；②選擇合適的表達(dá)載體；③對在表達(dá)載體上的基因序列進(jìn)行測定。 ： 是人工構(gòu)建的，含有λ DNA 的粘性 (cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體 DNA 載體雙重性質(zhì)的特殊載體。極端環(huán)境指普通微生物不能生存的環(huán)境，如高溫、低溫、低 PH、高 PH、高鹽、高輻射、含抗代謝物、有機(jī)溶劑、低營養(yǎng)、重金屬及有毒有害物等環(huán)境條件 二、 填空題 酶分子的 主鏈修 飾 、 酶分子的 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 、 酶分子的 化學(xué)交 聯(lián)修飾 、 酶分子的 大 分子修飾 、 酶分子的 親 和標(biāo)記修飾 、 酶分子的 基 因修飾 和 與輔助因子相關(guān)的修飾 。 酶工程 ：指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用的技術(shù) ，試對各種方法進(jìn)行綜合比較 ？ ① 吸附法 ： 分為物理吸附法及離子交換劑吸附法。 ② 共價(jià)結(jié)合法 ： 酶分子的活性基團(tuán)與載體表面活潑基團(tuán)之間經(jīng)化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的連接法 常用基團(tuán)： 氨基、羧基、酚基及咪唑基等 優(yōu)點(diǎn)： 酶與載體結(jié)合牢固，操作穩(wěn)定性良好。 缺點(diǎn)： 固定化酶只適用于小分子底物及小分子產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，不適用于催化大分子底物或產(chǎn)物的反應(yīng)。并憑借定向選擇（篩選）方法，獲得具有某些預(yù)期特征的進(jìn)化酶，從而排除其它方向的突變體。 此法便于自動控制、反應(yīng)條件恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，所以適用于連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，但處理雜菌污染比較困難 ，抗體酶的優(yōu)點(diǎn)有哪些？ 專一性和穩(wěn)定性更強(qiáng)、催化作用機(jī)制不同、能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng) ？ 誘導(dǎo)法、引入法、拷貝法 、 抗體庫法 微生物工程 一、 專業(yè)符號 生化需氧量 化學(xué)需氧量 紫外線 快中子 聚乙二醇 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽 代謝通量分析 代謝控制分析 二、 名詞解釋 （ Microbial Engineering） 利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)，是生物工程的重要組成部分 利用微生物 在一定條件下自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株，能達(dá)到純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)的目的 有意識的將微生物暴露于物理的、化學(xué)的或生物的誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程 有些葡萄糖的分解產(chǎn)物，雖然不導(dǎo)致 pH 下降，但它能阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所必需的酶的形成或酶的活性，即發(fā)生葡萄糖效應(yīng) 這種經(jīng)微生物生理作用 (代謝 )后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源 (如硫酸銨 )稱為生理酸性物質(zhì) 性物質(zhì) 經(jīng)菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機(jī)氮源 (如硝酸鈉 )稱為生理堿性物質(zhì) 在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構(gòu)成抗生素分子結(jié)構(gòu)的一部生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 13 分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)沒有大的變化，這些物質(zhì)稱為抗生素的前體。 次級代謝產(chǎn)物是指微生物代謝過程中所產(chǎn)生的其自身生長繁殖所不需要的物質(zhì)。 物理誘變因子 、 化學(xué)誘變劑 和 生物誘變劑 。天然培養(yǎng)基的特點(diǎn)是營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。 細(xì)菌或放線菌： 蔗糖、丁二酸鈉 酵母菌： 山梨醇、甘露醇 霉菌： KCl、 NaCl 一定濃度的 Ca2+、 Mg2+等二價(jià)陽離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，高滲培養(yǎng)基中不可缺少 PEG 和 Ca2+分別起什么作用？ PEG 可使原生質(zhì)體的膜電位下降，然后，原生質(zhì)體通過 Ca2+離子交聯(lián)而促進(jìn)凝集。因此，必須在融合體再生后，進(jìn)行幾 代自然分離、選擇，才能確定是否生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 15 獲得了真正融合子 ？ （ 1）烷化劑類化合物： 它能與一個或幾個核酸堿基起反應(yīng)，引起 DNA 復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生遺傳變異，這是一類在誘變育種中普遍使用的化學(xué)誘變劑。 堿基類似物誘發(fā)基因突變可導(dǎo)致堿基對的轉(zhuǎn)換，這種誘變易產(chǎn)生回復(fù)突變。 ？可以分為幾類？ 代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)，其中對終產(chǎn)物起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。 貼壁依賴性（錨地依賴性）： 大多數(shù)動物細(xì)胞只能附著或貼在固體或半固體表面上培養(yǎng)才能生長 原代細(xì)胞培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）： 直接從機(jī)體取材（細(xì)胞，組織或 器官）并置于體外條件生長到第一次移植繼代培養(yǎng)。 細(xì)胞單層培養(yǎng)法： 動物組織塊經(jīng)消化分散成單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊后，粘附于培養(yǎng)容器表面培養(yǎng)成新生細(xì)胞 單層的培養(yǎng)法。 1細(xì)胞融合： 在外力作用下，兩個或兩個以上異源動物細(xì)胞合并 為一個多核細(xì)胞，同時表達(dá)兩者或兩者以上細(xì)胞有益性狀，繼續(xù)培養(yǎng)，多核細(xì)胞核融合成為單核融合細(xì)胞（雜種細(xì)胞） 的過程，亦稱為動物體細(xì)胞雜交技術(shù)。能分化為體內(nèi)所有組織的能力。 人源化抗體 : 將小鼠抗體分子的 可變區(qū)或 互補(bǔ)決定區(qū)序列移植到人抗體可變區(qū)框架中而制成的抗體。 三、填空題 動物細(xì)胞工程研究主要內(nèi)容 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 18 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞融合技術(shù)；單克隆抗體技術(shù)（即雜交瘤技術(shù)）；動物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)；基因及細(xì)胞器染色體的改造和轉(zhuǎn)移；核轉(zhuǎn)移技術(shù)；胚胎干細(xì)胞技術(shù) 動物細(xì)胞所需營養(yǎng)因素 ① 氨基酸：氮源； ② 鹽類：鈉，鉀，鎂，鈣，硫酸根，碳酸氫根離子等； ③ 葡萄糖：碳源，供能； ④ 緩沖系統(tǒng)： CO2 緩沖系統(tǒng)或 HEPES； ⑤ 生長因子： EGF（表皮生長因子）等； ⑥其他成分：維生素，微量元素，有機(jī)補(bǔ)充物，激素生長因子，嘌呤，谷胱甘肽等。 無血清培養(yǎng)基中加入的補(bǔ)充因子 —— 細(xì)胞生長因子與激素； B .特殊因子 —— 促貼壁因子（纖粘連因子，層粘連因子）； 保存動物種質(zhì)細(xì)胞最有效的方法 ? 超低溫冰凍法： 70℃以下冰箱或液氮（ 196℃）長期 超低溫法常用保護(hù)劑 及機(jī)理 ？ 保護(hù)劑：二甲亞砜 DMSO，濃度 %；甘油 5%20%。 1基因工程抗體種類？ （ 1） 大分子抗 體：①嵌合抗體；②重構(gòu)抗體（ CDR 植入抗體）； （ 2） 小分子抗體：① Fab抗體；②單鏈抗體（ ScFv）：雙功能（雙特異性）抗體，催化抗體。 優(yōu)點(diǎn)： ① 簡便，可靠性與重復(fù)性好； ② 分離混雜細(xì)胞的優(yōu)良方法； ③ 可用于建立細(xì)胞株，分離細(xì)胞變種； ④ 評價(jià)藥物及毒物對細(xì)胞生長的影響； ⑤ 篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤制備單克隆抗體 淋巴細(xì)胞雜交瘤的形成原理是什么？為什么 HAT培養(yǎng)基可用于篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤？ 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 20 原理： 體外能無限增值的骨髓瘤細(xì)胞（ HGPRT或 TK— ） 與能分泌抗體的小鼠脾 B 淋巴細(xì)胞融合，制備雜種細(xì)胞。 （ 3） 一親本細(xì)胞（ HGPRT或 TK—骨髓瘤細(xì)胞） +另一親本（具有合成 DNA 的兩條途徑，不能在體外長期分裂繁殖的淋巴細(xì)胞） =融合的雜種細(xì)胞，可通過補(bǔ)救合成 DNA，存活。 簡述制備雜交瘤生產(chǎn) McAb 的工藝路線？ ：小鼠骨髓瘤細(xì)胞，人或鼠免疫淋巴細(xì)胞； b 細(xì)胞融合：免疫脾淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞用 PEG 融合； c 雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化培養(yǎng)： ① HAT 選擇系統(tǒng)篩選雜交瘤細(xì)胞； ②檢測含特定抗體的陽性克隆 —— 酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA，放射免疫法 RIA，免疫熒光法； ③克隆化培養(yǎng) —— 有限稀釋法； d 單克隆抗體的大量生產(chǎn)： 體外培養(yǎng)法 —— 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管；體內(nèi)培養(yǎng)法 —— 實(shí)體瘤法和腹水的制備； ：常用硫酸銨沉淀法，超濾法，鹽析法生物技術(shù)復(fù)習(xí)思考題 07437 21