【正文】 : 是指通過蛋白質(zhì)化學、晶體學和動力學的研究，獲取關于蛋白質(zhì)物理、化學等各方面的信息，在此基礎上，對編碼該蛋白質(zhì)的基因進行有目的的改造，并 通過基因工程等手段將其進行表達和分離純化，最終得到比天然蛋白質(zhì)更好的產(chǎn)物。 基因工程中，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組 DNA 分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉化，這種敏感細胞稱為人工感受態(tài)細胞。 ： 是指用化學方法合成的一段由 1012 個核 苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。 基因工程操作中的轉化是泛指將重組 DNA 轉入宿主中的方法。這些阻遏物的存在可以抑制 Lac 操縱子的表達。 當它 的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新 的DNA 分子，而易于連接重組。裝卸手續(xù)簡單 。 表達系統(tǒng)中常用的強啟動子 Lac Trp λ PL λ PR 基因制備方法 ①基因分離的物理方法 ； ②鳥槍法；③ cDNA 文庫的建立與基因分離；④基因組文庫法；⑤基因的化學合成；⑥聚合酶鏈式反應技術（ PCR）。 片段的連接方法 平頭 雙鏈 DNA 分子的連接（ T4DNA 連接酶）；粘性末端 DNA 片段的連接（ DNA 連接酶）；平末端 DNA 片段的連接（同聚物加尾法，銜接物連接法， DNA 接頭連接法）。如 DNA 分子中某段的 G≡ C 堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（ Tm）就高。：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。 ⑤ 基因的化學合成 :優(yōu)點 : 。 ⑥ 聚合酶鏈反應技術（ PCR） :優(yōu)點： 。 cDNA鏈的合成 。多的重組體中篩選出特定的基因 . 名原則是什么 ? 凡能識別并切割雙螺旋 DNA 分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。② mRNA的 5′ 端與 3′ 端的正確加工，提高 mRNA 的穩(wěn)定性 。 的加工與基因高效表達 :絕大多數(shù)較高等的真核基因含有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在 mRNA的加工過程中，在細胞核中被加工去除而產(chǎn)生成熟的 mRNA。 :一般來講：①質(zhì)?？?貝數(shù)多，基因表達水平高；②表達質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性與基因高效表達 。無法控制外源基因插入方向 ； B. 銜接物 連接法 :優(yōu)點 ：克隆后還可回收原插入片斷 ； 缺點 ： 如果待克隆的 DNA 片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在 5?OH和 3‘ –OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。 ：①目的抗原基因的選擇和獲得（構建 cDNA 文庫， PCR 擴增，人工合成）；②選擇合適的表達載體；③對在表達載體上的基因序列進行測定。 ： 是人工構建的，含有λ DNA 的粘性 (cos)末端序列、質(zhì)粒復制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體 DNA 載體雙重性質(zhì)的特殊載體。極端環(huán)境指普通微生物不能生存的環(huán)境，如高溫、低溫、低 PH、高 PH、高鹽、高輻射、含抗代謝物、有機溶劑、低營養(yǎng)、重金屬及有毒有害物等環(huán)境條件 二、 填空題 酶分子的 主鏈修 飾 、 酶分子的 側鏈基團修飾 、 酶分子的 化學交 聯(lián)修飾 、 酶分子的 大 分子修飾 、 酶分子的 親 和標記修飾 、 酶分子的 基 因修飾 和 與輔助因子相關的修飾 。 酶工程 ：指通過化學方法、酶學方法和 DNA 重組技術改善自然酶的組成、結構和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進行應用的技術 ，試對各種方法進行綜合比較 ？ ① 吸附法 ： 分為物理吸附法及離子交換劑吸附法。 ② 共價結合法 ： 酶分子的活性基團與載體表面活潑基團之間經(jīng)化學反應形成共價鍵的連接法 常用基團： 氨基、羧基、酚基及咪唑基等 優(yōu)點： 酶與載體結合牢固，操作穩(wěn)定性良好。 缺點： 固定化酶只適用于小分子底物及小分子產(chǎn)物的轉化反應，不適用于催化大分子底物或產(chǎn)物的反應。并憑借定向選擇（篩選）方法，獲得具有某些預期特征的進化酶，從而排除其它方向的突變體。 此法便于自動控制、反應條件恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，所以適用于連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，但處理雜菌污染比較困難 ，抗體酶的優(yōu)點有哪些？ 專一性和穩(wěn)定性更強、催化作用機制不同、能催化一些天然酶不能催化的反應 ？ 誘導法、引入法、拷貝法 、 抗體庫法 微生物工程 一、 專業(yè)符號 生化需氧量 化學需氧量 紫外線 快中子 聚乙二醇 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽 代謝通量分析 代謝控制分析 二、 名詞解釋 （ Microbial Engineering） 利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術，是生物工程的重要組成部分 利用微生物 在一定條件下自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株，能達到純化、復壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)的目的 有意識的將微生物暴露于物理的、化學的或生物的誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程 有些葡萄糖的分解產(chǎn)物，雖然不導致 pH 下降，但它能阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所必需的酶的形成或酶的活性，即發(fā)生葡萄糖效應 這種經(jīng)微生物生理作用 (代謝 )后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源 (如硫酸銨 )稱為生理酸性物質(zhì) 性物質(zhì) 經(jīng)菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機氮源 (如硝酸鈉 )稱為生理堿性物質(zhì) 在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構成抗生素分子結構的一部生物技術復習題 07437 13 分，而化合物本身的結構沒有大的變化，這些物質(zhì)稱為抗生素的前體。 次級代謝產(chǎn)物是指微生物代謝過程中所產(chǎn)生的其自身生長繁殖所不需要的物質(zhì)。 物理誘變因子 、 化學誘變劑 和 生物誘變劑 。天然培養(yǎng)基的特點是營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。 細菌或放線菌： 蔗糖、丁二酸鈉 酵母菌： 山梨醇、甘露醇 霉菌： KCl、 NaCl 一定濃度的 Ca2+、 Mg2+等二價陽離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，高滲培養(yǎng)基中不可缺少 PEG 和 Ca2+分別起什么作用？ PEG 可使原生質(zhì)體的膜電位下降，然后，原生質(zhì)體通過 Ca2+離子交聯(lián)而促進凝集。因此，必須在融合體再生后，進行幾 代自然分離、選擇，才能確定是否生物技術復習題 07437 15 獲得了真正融合子 ？ （ 1）烷化劑類化合物： 它能與一個或幾個核酸堿基起反應，引起 DNA 復制時堿基配對的轉換而發(fā)生遺傳變異，這是一類在誘變育種中普遍使用的化學誘變劑。 堿基類似物誘發(fā)基因突變可導致堿基對的轉換，這種誘變易產(chǎn)生回復突變。 ？可以分為幾類？ 代謝網(wǎng)絡分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點，其中對終產(chǎn)物起決定作用的少數(shù)節(jié)點稱為主節(jié)點。 貼壁依賴性（錨地依賴性）： 大多數(shù)動物細胞只能附著或貼在固體或半固體表面上培養(yǎng)才能生長 原代細胞培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）： 直接從機體取材（細胞，組織或 器官）并置于體外條件生長到第一次移植繼代培養(yǎng)。 細胞單層培養(yǎng)法： 動物組織塊經(jīng)消化分散成單個細胞或細胞團塊后，粘附于培養(yǎng)容器表面培養(yǎng)成新生細胞 單層的培養(yǎng)法。 1細胞融合： 在外力作用下，兩個或兩個以上異源動物細胞合并 為一個多核細胞，同時表達兩者或兩者以上細胞有益性狀，繼續(xù)培養(yǎng)，多核細胞核融合成為單核融合細胞（雜種細胞） 的過程，亦稱為動物體細胞雜交技術。能分化為體內(nèi)所有組織的能力。 人源化抗體 : 將小鼠抗體分子的 可變區(qū)或 互補決定區(qū)序列移植到人抗體可變區(qū)框架中而制成的抗體。 三、填空題 動物細胞工程研究主要內(nèi)容 生物技術復習題 07437 18 動物細胞培養(yǎng)技術；細胞融合技術；單克隆抗體技術（即雜交瘤技術）；動物大規(guī)模培養(yǎng)技術；基因及細胞器染色體的改造和轉移；核轉移技術；胚胎干細胞技術 動物細胞所需營養(yǎng)因素 ① 氨基酸：氮源； ② 鹽類：鈉，鉀，鎂，鈣，硫酸根，碳酸氫根離子等； ③ 葡萄糖：碳源，供能； ④ 緩沖系統(tǒng)： CO2 緩沖系統(tǒng)或 HEPES； ⑤ 生長因子： EGF（表皮生長因子）等； ⑥其他成分：維生素，微量元素，有機補充物，激素生長因子，嘌呤，谷胱甘肽等。 無血清培養(yǎng)基中加入的補充因子 —— 細胞生長因子與激素； B .特殊因子 —— 促貼壁因子（纖粘連因子，層粘連因子）； 保存動物種質(zhì)細胞最有效的方法 ? 超低溫冰凍法： 70℃以下冰箱或液氮（ 196℃）長期 超低溫法常用保護劑 及機理 ？ 保護劑：二甲亞砜 DMSO，濃度 %；甘油 5%20%。 1基因工程抗體種類？ （ 1） 大分子抗 體：①嵌合抗體；②重構抗體（ CDR 植入抗體）； （ 2） 小分子抗體：① Fab抗體；②單鏈抗體（ ScFv）：雙功能（雙特異性）抗體，催化抗體。 優(yōu)點： ① 簡便，可靠性與重復性好； ② 分離混雜細胞的優(yōu)良方法； ③ 可用于建立細胞株，分離細胞變種； ④ 評價藥物及毒物對細胞生長的影響； ⑤ 篩選淋巴細胞雜交瘤制備單克隆抗體 淋巴細胞雜交瘤的形成原理是什么？為什么 HAT培養(yǎng)基可用于篩選淋巴細胞雜交瘤？ 生物技術復習題 07437 20 原理： 體外能無限增值的骨髓瘤細胞（ HGPRT或 TK— ） 與能分泌抗體的小鼠脾 B 淋巴細胞融合，制備雜種細胞。 （ 3） 一親本細胞（ HGPRT或 TK—骨髓瘤細胞） +另一親本（具有合成 DNA 的兩條途徑，不能在體外長期分裂繁殖的淋巴細胞） =融合的雜種細胞，可通過補救合成 DNA，存活。 簡述制備雜交瘤生產(chǎn) McAb 的工藝路線？ ：小鼠骨髓瘤細胞，人或鼠免疫淋巴細胞； b 細胞融合：免疫脾淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞用 PEG 融合； c 雜交瘤細胞篩選及克隆化培養(yǎng)： ① HAT 選擇系統(tǒng)篩選雜交瘤細胞； ②檢測含特定抗體的陽性克隆 —— 酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA，放射免疫法 RIA，免疫熒光法； ③克隆化培養(yǎng) —— 有限稀釋法； d 單克隆抗體的大量生產(chǎn)： 體外培養(yǎng)法 —— 旋轉培養(yǎng)管；體內(nèi)培養(yǎng)法 —— 實體瘤法和腹水的制備； ：常用硫酸銨沉淀法，超濾法，鹽析法生物技術復習思考題 07437 21