【正文】 球最大的單條萬噸級維生素 C 17 生產(chǎn)線以及享有自主知識產(chǎn)權(quán)的全化學(xué)合成黃連素等產(chǎn)品，硫糖鋁、金剛烷胺和金剛乙胺三個產(chǎn)品順利通過了美國 FDA 認(rèn)證檢查。D山梨醇轉(zhuǎn)化 L山梨糖 的生物轉(zhuǎn)化率達(dá) 98%以上。正常情況下，維生素 C 絕大部分在體內(nèi)經(jīng)代謝分解成草酸或與硫酸結(jié)合生成抗壞血酸 2硫酸由尿排出；另一部分可直接由尿排出體外。 。 9．提高人體的免疫力。 由于企業(yè)間競相壓價，挑起了全世界范圍的“ VC 大戰(zhàn)”，打破了原來的世界 VC 格局。 實踐證明，當(dāng)時提高產(chǎn)量的決定是完 全正確的。 二、 實驗原理 （一） 15L 小型發(fā)酵罐 用于實驗室小型發(fā)酵罐的滅菌方法有兩種：高壓蒸汽滅菌器滅菌和原位滅菌法。 小型發(fā)酵罐的輔助容器的滅菌也應(yīng)該考慮同樣的因素，這與復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐，玻璃發(fā)酵罐和其它型號發(fā)酵罐類似。滅菌的保持時間應(yīng)該從容器溫度最底部分（裝有培養(yǎng)基的容器通常是中部）達(dá)到所需要溫度開始計時，可以從排氣閥門中排除白色蒸汽為準(zhǔn)。此外，發(fā)酵罐或容器的體積越 31 大，則加熱和冷卻的速率就越慢。電極在放入高壓蒸汽滅菌器中前，要用不吸水的棉花塞好并包扎好。穩(wěn)定劑添加不當(dāng)，就難以發(fā)揮其作用，最常用的方法是，將穩(wěn)定劑和干物料（如白砂糖和淀粉）預(yù)先用 1： 51：10 的比例從干粉狀態(tài)充分混合均勻，然后再邊攪拌邊添加到液體物料中溶解。 (二 ) 實罐滅菌 1. 啟動蒸汽發(fā)生器。 ⒀ 為延長發(fā)生器使用期限，防止電熱器結(jié)垢過熱燒毀及水位控制器結(jié)垢卡死 ,發(fā)生器宜采用軟水或純水如 條件所限，采用煮沸過的水亦可收到良好效果。 當(dāng)溫度達(dá)到工藝要求時，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，空氣流量，罐壓，標(biāo)定溶氧電極的斜率及修正 pH 電極的零點。 用洗耳球?qū)l(fā)酵液吸到干凈的試管中， 將取完后的樣品 封口后， 按順序 放置于冰箱中冷藏。 測完 pH 后我們有對 16 號試管中的樣品進(jìn)行聞味，可以聞出酸奶的味道越來越濃了 。 所以不能從發(fā)酵所得酸奶的粘稠度鑒別其好壞，只能通過測 pH 看酸度 來鑒別其好壞 。 ② 為了讓酸奶稠度增加，制作當(dāng)中可以加入多種增稠劑如明膠或膳食纖維類物質(zhì)。 在乳酸菌發(fā)酵的過程中并沒有通入無菌空氣， 因為 乳酸 菌是厭氧型微生物，故其 發(fā)酵不 用 通入氧 氣。 ⑵ 夾緊 J2，將出料管放入接料瓶，松開口，發(fā)酵液被壓入接料瓶（也可以通入減少排氣，增加罐壓來加快取樣速度）。 8. 調(diào)整閥 V3，排除夾套上法蘭溝槽內(nèi)的水。 ⑽ 當(dāng)發(fā)生器水位降到低水位時，綠色供水指示燈亮，約 3 秒種即可到達(dá)正 35 常水位，綠色供水指示燈熄滅，水泵停止供水。 ⑷ 將 pH 電極裝入 N17 口，并用螺帽蓋緊電極上端口，防止因電纜插口受潮導(dǎo)致電極故障。砂糖中的酵母和其他細(xì)菌是產(chǎn)品中微生物的來源之一，再將糖添加到產(chǎn)品中去的過程中應(yīng)有嚴(yán)密的措施來保證成品的細(xì)菌指標(biāo)，保證產(chǎn)品質(zhì)量。所以，如果發(fā)酵罐要放入高壓蒸汽滅菌器中滅菌，要將出口過濾器的出口塞好蓋帽。體積變化是有益還是有害，取決于這些效果的平衡。所以無論采用哪種加熱滅菌方法，最好在最短時間內(nèi)將發(fā)酵罐或容器的溫度升至滅菌溫度，達(dá)到滅菌時間時間后再以最快的速度進(jìn)行冷卻。市面上也有可以用原位滅菌的復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐。每隔 一 小時用 吸 耳球?qū)l(fā)酵 液吸到 干凈的試管 中 ， 封口后 放入冰箱，留待最后 通過 測定 酸奶 PH 和聞氣味 ，來鑒別酸奶發(fā)酵的好壞，最后清洗發(fā)酵罐。 東北制 藥集團(tuán)能有今天的成就全靠當(dāng)初的改革轉(zhuǎn)制。在該車間需要注意的就是不要隨便碰罐，和管子 。 VC 是一種強抗 氧化劑，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，從而發(fā)揮抗氧化作用。健康的牙床緊緊包住每一顆牙齒。 （ 1）工藝原理 ① L抗壞血酸易遭破壞 1) 溫度 2) 金屬離子 3) 空氣接觸 4) pH ② 易氧化 ③ 易分解 ④ 變質(zhì)的標(biāo)志：色澤變黃 （ 2）工藝過程 ① 配料比：粗維生素 C：蒸餾水：活性炭：晶種 = 1： ： ： ② 步驟 1) 粗維生素 C 真空干燥 2) 加蒸餾水?dāng)嚢枞芙? 3) 加活性炭，攪拌 510min，壓濾 4) 濾液加入結(jié)晶罐，再加入 50L 左右的乙醇，攪拌 5) 降溫、加晶種，結(jié)晶 6) 將晶體離心甩濾，冰乙醇洗滌 7) 甩濾、干燥器中干燥，得精制 VC ③ 整個過程耗時 7680h ④ 總收率 %（以山梨醇計） 此步驟的生產(chǎn)流程可簡單寫為： 粗 VC ?????? ?? 加水、加活性炭、過濾 VC水溶液 ????? ?? 結(jié)晶、脫水、干燥 VC 粉末 ??? ?? 過篩、檢測 大顆粒 ?? ?? 包裝 成品 （ 3）注意事項 ① 結(jié)晶時， 結(jié)晶罐中 最高溫度不得高于 45℃，最低不得低于 4℃，不能再 21 高溫下加晶種 ； ① 回旋干燥要嚴(yán)格控制循環(huán)水溫和時間，夏天循環(huán)水溫高，可用小冷凝器降溫 ； ② 壓濾時遇停電，應(yīng)立即關(guān)空壓閥保壓 。應(yīng)杜絕火源，以免氫氣發(fā)生爆炸 2) 廢鎳催化劑可壓制成塊，冶煉回收 3) 再生廢液中的鎳經(jīng)沉淀后可回收 4) 廢酸、廢堿經(jīng)中和后放入 下水道 2. 兩步發(fā)酵法 兩步發(fā)酵法 為東北制藥廠 VC 總公司生產(chǎn) VC 的方法，其 可以系統(tǒng)的分為：發(fā)酵、提取、轉(zhuǎn)化、精制四個步驟。親身體會到那么大的罐體，更加深了我們對生物反應(yīng)罐的認(rèn)識。如飲水量少，只能讓一部分雞飲上疫苗，造成免疫不均勻；飲水量太多，很長時間飲不完，造成疫苗效價降低。 2．凍干苗：加保護(hù)劑或穩(wěn)定劑、混合、分裝、凍干 。 c) 病毒性細(xì)胞培養(yǎng)疫苗制造 工序一： 種毒與毒種繼代 制苗用種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢驗合格，多為凍干品。無菌動物（ GF）要求不帶有任何用現(xiàn)有的方法可以檢出的微生物。飲水 pH 為 ～ ，鼠盒上帶過濾帽，空氣亦應(yīng)經(jīng)過一定的過濾，工作人員穿干凈服裝操作，此類動物的微生物控制標(biāo)準(zhǔn)基本與 SPF 相同，不同之處為血清病毒抗體檢查（腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒??）經(jīng)?？蓹z出一定滴度的抗體，但不允許出現(xiàn)臨床癥狀和臟器的病理變化和自然死亡。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。各工序需安裝紫外線燈。接種活疫苗的話，會發(fā)生輕微的感染，血中與細(xì)胞雙方的抵抗性會提高。 實習(xí)地點 ㈠ ： 遼寧益康生物制品有限公司 一、 遼寧益康生物制品有限公司 簡介 ： 遼寧益康生物制品有限公司是國內(nèi)生產(chǎn)、經(jīng)營動物生物制品的骨干企業(yè)，是農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的禽流感滅活疫苗定點生產(chǎn)企業(yè)，是經(jīng)有關(guān)部門認(rèn)定的 “遼寧省高新技術(shù)企業(yè) ”。 3. 了解東北制藥 集團(tuán) VC 總 公司的發(fā)展歷史 。 1) 疫苗 的 概念及 分類： a) 疫苗 概念： 泛指所有用減毒或殺死的病原生物 (細(xì)菌、 病毒、立克次體等 )或其抗原性物質(zhì)所制成，用于預(yù)防接種的生物制品 。一般生產(chǎn)區(qū)包括 安 瓿 的洗烘、工作服的洗滌等； 1 萬級潔凈區(qū)包括稀配、灌溉，且灌封機自帶局部 100 級層流。此種動物在自然界中并不存在，必須用人為的方法培育出來。 SPF 動物的祖先是無菌動物，按理來說，無菌動物的子宮內(nèi)和卵中應(yīng)該是無菌的，然而，有些病毒實際上是通過親代傳給胎兒的，因此，在作出無菌動物和 SPF 動物之前，必須充分考慮這個問題。 普通動物（ CV）要求必須不帶有人獸共患病原體及體外寄生蟲。 2．培養(yǎng) 10 3． 收獲病毒 工序四 ： 配苗 收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無菌檢驗合格后配苗。培養(yǎng)當(dāng)出現(xiàn) 70%~85%以上細(xì)胞病孌時，即可收獲。 1℃ 照蛋 轉(zhuǎn)瓶 滅菌 晾干 精洗 粗洗 培養(yǎng)液 冷庫 15℃ 解凍 28℃ 病毒液暫存 15℃ 化苗 配苗 中間品檢驗 分裝 凍干保護(hù)劑 配制 滅菌 滅菌 西林瓶 精洗 粗洗 裝箱 貼標(biāo) 軋蓋 壓塞 入庫 15℃ 標(biāo)簽 滅菌 清洗 鋁蓋 成品檢驗 滅菌 粗洗 膠塞 精洗 凍干干燥 半壓塞 14 ⒊菌種培養(yǎng)弱毒疫苗生產(chǎn)工藝流程 6) 舉例說明 雞新城 疫苗的 使用 方法： a) 飲水免疫 首先要保證足夠的飲水器，并把飲水器清洗干凈， 達(dá)到 無抗菌、消毒藥物殘留；飲水免疫前停水 2~4 小時；疫苗水中不含金屬離子和氯離子，可使用涼開水或蒸餾水，最 好使用去離子水，并在其中加入 2~3%鮮牛奶或 ~%脫脂奶粉，以穩(wěn)定病毒活性。激發(fā)了我們對發(fā)酵罐知識點的回憶。 1. 萊氏法 是維生素 C 生產(chǎn)的經(jīng)典方法，是由 Reichstein 和 Grussner 研究開發(fā)的。 2酮基 L古龍酸在甲醇中用濃硫酸催化酯化 ，攪拌并加熱，使溫度為 66~68℃ ，反應(yīng)4h 左右即為酯化終點， 生成 2酮基 L古龍酸甲酯，加 NaHCO3 轉(zhuǎn)化生成維生素C 鈉鹽，經(jīng)氫型離子交換樹脂酸化得到維生素 C。這種情況在皮膚表面發(fā)生，則產(chǎn)生淤血、紫癍；在體內(nèi)發(fā)生則引起 疼痛和關(guān)節(jié)漲痛。為此，谷胱甘肽和酶起著重要作用。當(dāng)然，如果 VC 片中添加一些對人體有益的成分，也會使其價格比較高。 目前，沈陽東北制藥集團(tuán)的 VC 生產(chǎn)能力約為每年 12 萬噸，是國內(nèi)第一大廠家，在世界排名第三。 圖 6 校正滅菌參數(shù) 圖 7 對組裝好的罐子蒸汽滅菌 圖 8 自控蒸汽發(fā)生器 27 第三天： 將發(fā)酵罐的鐘罩卸下后，在火焰的保護(hù)下打開接種口，倒入大約15 袋的牛奶，然后再倒入大約 10 袋的酸奶，最后加入一定量的白糖，然后旋緊接種蓋，移去火焰圈。 體積小于 1520L 的攪拌型發(fā)酵罐通常是玻璃罐體，不銹鋼灌頂和底座的復(fù)合結(jié)構(gòu)。尤其是對于原位滅菌的發(fā)酵罐，空消得第一次滅菌可以將滅菌時間延長。 （ 2）蒸汽原位滅菌 發(fā)酵罐采用蒸汽原位滅菌時可采用夾套蒸汽加熱或電加熱器進(jìn)行加熱。在滅菌時要記住不能將輔助瓶裝的太滿，裝好后，所有的容器都要安全地扎好，以避免泄露。理化指標(biāo)：脂肪≥ %，蛋白質(zhì)≥ %，干物質(zhì)≥ %，酸度 1618 度， 72%酒精試驗陰性，活性狀態(tài)良好，煮沸實驗無異常。 2. 連接管蓋上的接管 ⑴ 取樣閥 K8 口與過濾器無菌空氣出口 K6 用硅膠聯(lián)通并放開彈簧夾 J2。隨手關(guān)閉放汽閥。 6. 當(dāng)培養(yǎng)基 90℃以上，開蒸汽冷凝水閥 V3，微開蒸汽閥 S2，蒸汽進(jìn)入鐘罩內(nèi)，當(dāng)鐘罩頂排氣口 V4 有蒸汽排除時， 2 分鐘后關(guān)閉 V4 并關(guān)小 V3，當(dāng)罐溫接近120℃或保溫溫度時微開閥 V4 適量排氣，并調(diào)整蒸汽閥 S1 維持罐溫。置蠕動泵開關(guān)于自動狀態(tài)。 發(fā)酵過程中將轉(zhuǎn)速設(shè)定在 80rpm，在這個轉(zhuǎn)速下，酵母菌可以與培養(yǎng)液（牛奶）和葡萄糖等營養(yǎng)成分充 分接觸，同時使發(fā)酵罐內(nèi)各處的溫度均勻，使得發(fā)酵能夠良好的進(jìn)行， 而且 慢速的攪拌不會破壞蛋白質(zhì)膠體，因而 會使 產(chǎn)品 變得 細(xì)膩，并有一定稠度。這時直接出售的酸奶叫做凝固型酸奶。 六、討論 本實驗所用的 15L 發(fā)酵罐與生物工程課上用的 5L 發(fā)酵罐的比較： 本實驗所用的主要儀器是 15L BGZ 發(fā)酵罐，該發(fā)酵罐屬于小型發(fā)酵罐， 對于實驗室小型發(fā)酵罐來說，其滅菌方法有兩種 ：高壓蒸汽滅菌器滅菌法和原位滅菌法。發(fā)酵所得酸奶呈 乳 白 39 色，成黏著態(tài) ，不過可惜的是我們沒有親口嘗到自己所發(fā)酵的酸奶， 因為畢竟是在實驗室中發(fā)酵的，環(huán)境條件沒有達(dá)到生產(chǎn)要求，在去參觀遼寧益康生物制品有限公司和東北制藥集團(tuán)時 ， 他們 生產(chǎn)車間的潔凈程度相當(dāng)高了，而我們的遠(yuǎn)沒有達(dá)到，所以不能食用。 每次發(fā)酵結(jié)束，必須在控制器初始化菜單中確認(rèn)“發(fā)酵結(jié)束”，關(guān)閉空氣壓縮機。 取 5 千克鮮奶煮沸消毒，加白糖 300 克攪拌，讓其自然冷卻（冷卻中最好能攪拌 23 次，以免乳脂結(jié)皮）。 ⒂ 為確保安全，操作人員應(yīng)密切注意檢查壓力示 ,如發(fā)現(xiàn)壓力異常應(yīng)立即關(guān)機。 ⑵ 插上電源插頭，把水泵插頭插入發(fā)生器插座。保加利亞乳桿菌最適 合生長溫度為 4043℃，最低生長溫度為 22℃，最高生長溫度為 ℃。真空的產(chǎn)生是極其不利的，不利的影響主要有：會導(dǎo)致容器的破裂，空氣從密封不嚴(yán)的地方吸入容器或使空氣過濾器染菌或者使熱培養(yǎng)基溢出。準(zhǔn)備工作應(yīng)該有條理地進(jìn)行，并且檢查兩遍，因為任何錯 誤都會造成發(fā)酵的損失或需要重復(fù)滅菌。應(yīng)該記住，加熱和冷卻時容器內(nèi)溫度都將滯后于高壓蒸汽滅菌親內(nèi)的溫度，尤其是對于那些由熱 傳遞性能不是很好的玻璃耐高壓塑料制成的容器。 攪拌發(fā)酵罐一般是裝好培養(yǎng)基后進(jìn)行實罐 滅菌。 如果采用常用的水蒸氣滅菌，則器皿的材料要能夠耐壓。 東藥生產(chǎn) VC 也是 從最底層 一步一步摸索著前進(jìn) 直到現(xiàn)在的輝煌成就， 要想一步登天是 不太現(xiàn)實的 。日本武田公司關(guān)閉了其在美國的工廠。 促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的生成，提高機體對外來和惡變細(xì)胞的識別和殺滅；參與免疫球蛋白的合成； 提高 CI 補體酯