【正文】 組 ( v. ,)。結果表明， 50ng/ml 的 EGF 對牛卵母細胞的成熟有顯著促進作用，而對胚 胎發(fā)育沒有直接影響。 200uM CYS 在本實驗中對卵 母細胞成熟和胚胎發(fā)育均沒有顯著影響。胱氨酸的攝入對培養(yǎng)條件下細 18 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 胞內(nèi)保持 GSH 的水平很關鍵 ， 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 EGF 對受精后 4細胞期胚胎的發(fā)育沒有影響 [31]，對囊胚發(fā)育上也沒有顯著效果。這種差異可能是由于不同的培養(yǎng)體系所造成 的。 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組凋亡指數(shù)顯著低于 對照組(, 和 ， P)，說明成熟液添加適當濃度 EGF 或 CYS 能 夠顯著降低胚胎細胞凋亡。 檢測胚胎發(fā)育不同階段細胞凋亡情況，分析胚胎細胞發(fā)生凋亡時間。隨機選出 23 個通透好的胚胎，先用 DNase+DNAbuffer 中處理 40min，再用 TUNEL 試劑盒處理。 6h 后，將受精后胚胎撿起，用發(fā)育液（ CR 1）洗三遍，放入提前配好并平衡 2h 以上的發(fā)育液里，也是 20 個 /100ul 微滴規(guī)格 。 撿卵及成熟培養(yǎng) 在體視顯微鏡下，挑選卵胞質(zhì)均勻、卵丘細胞層完整且至少有 35 層以上的 COCs （卵丘 卵母細胞復合體），在洗卵液（ PBS+2%FBS+10181。據(jù)研究， CYS 能夠細胞質(zhì)成熟，在體外受精中促進雄原核的形成。 Caspase3 通常以 酶原（ 32 KD16）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase3 由兩個大亞基（ 17KD）和兩個小亞基（ 12 KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最 終導致細胞凋亡。 PCR 即是檢測這些特異性基因的常用方法。 AnnexinV 進行熒光素（ FITC、 PE）或生物素標記，以標記了的 AnnexinV 作為熒光探針利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。體外培養(yǎng)環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的物理化學因素刺激或者培 養(yǎng)液缺乏胚胎所需的一些重要細胞因子或激素都是造成此現(xiàn)象的原因。有人發(fā)現(xiàn) [23]， 凋亡的誘導不依賴于 P53 抑制劑 ， 而是依賴于 Bak 或者 Bax?？梢娛笈呗殉仓械穆涯讣毎诒┞队? PAHs 后 ， 是通過一個 AHR 依賴的方式增加 Bax 的表達來促發(fā)凋亡的 [19]。這方面的證據(jù)多來自于對小鼠的研究 。 卵母細胞凋亡現(xiàn)象 卵母細胞與其他類型細胞一樣，也在不斷地退化死亡。 In Vitro Fertilized Embryo。結果表明 50ng/ml EGF 顯著提高卵母細胞的卵裂率。說明 EGF 對卵母細胞成熟有促進作用。 Cell Apoptosis。在許多無脊椎動物和脊 椎動物中，大量的生殖細胞在發(fā)育的不同階段丟失 [1,2]。因缺陷死亡理 論認為 ， 凋亡能除去減數(shù)分裂時發(fā)生配對錯誤或重組異常的卵母細胞 ， 即體內(nèi)存在 一個監(jiān)控機制 ， 可發(fā)現(xiàn)并除去有缺陷的卵母細胞 ， 而保留能正常進行減數(shù)分裂的卵 母細胞來形成原始卵泡 。胚胎時期生殖細胞的大量丟失與 成體中發(fā)生的卵泡閉鎖雖然本質(zhì)上都是細胞凋亡 ， 但它們遵循 的卻是不同的調(diào)控機 制。 此外 ， 當?shù)蛲霭l(fā)生時 BH3 單結構域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。動物受精后 胚胎基因組并不是立即轉錄表達的，而是先表達母源基因組，再表達胚胎基因組。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在 凋亡中晚期的細胞和死細胞， PI 能夠透細胞膜而使細胞核紅染。 如 LMPCR 被用來擴增凋亡細胞產(chǎn)生的 DNA 片段。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞， Caspase3 的活性明顯下降。有些研究顯示， CYS 對卵母細 胞的成熟沒有影響但能夠促進囊胚率和孵化囊胚率。L PS）中沖洗 3 遍，然后在成 熟培養(yǎng)液 (M199+10%FBS+10181。 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 卵母細胞做完體外受精后，培養(yǎng) 48h 后換半液。 （ 2） TUNEL 陰性對照 為檢測熒光標記是否標上，作陰性對照，隨機挑選 23 個通透好的胚胎，用 TUNEL 處理時不加酶液，只在標記液中處理 12h。比較不同 發(fā)育階段囊胚（囊胚，擴張囊胚，孵化囊胚）之間的胚胎細胞凋亡情況。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文 15 試驗三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗一的結果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來提高胚胎的質(zhì)量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時間。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉錄因子，在胚胎 2細胞階段存在，而 4到 16 細胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測到。 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γgluta。 CYS 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對卵母細胞的成熟有一定促進作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應。 EGF 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對牛卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 100 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對胚胎囊胚率沒有影響。 試驗三，胚胎發(fā)育液添加不同濃度 EGF（ 0， 50,100ng/ml）和 CYS（ 0,100,200uM） (1) 發(fā)育液添加 EGF（ 0， 50,100ng/ml） (2) 發(fā)育液添加 CYS（ 0,100,200uM） 與試驗一相同處理過程，分析對胚胎發(fā)育及胚胎細胞凋亡的影響。 RNAase 處理 實驗組，陰性對照組，陽性對照組三組做完 TUNEL 處理后，在 RNase+ RNAbuffer 中處理 40min，降解細胞質(zhì)內(nèi)的 RNA，去除干擾。 TUNEL 試劑盒工作原理 TUNEL 試劑盒（ Roche）含有酶液和熒光標記液。g/mLLH+1181。 8 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 2 實驗研究 實驗方法 口吸撿卵針的準備 將玻璃細管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時候根據(jù)手感迅速向兩側拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。目前對凋亡 細胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達水平的比例，根據(jù)其比例分析細胞是存活還是凋亡。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉 移 酶 介 導 的 缺 口 末 端 標 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報道了該方法。如在小鼠， 2細胞階段以后；在人和豬， 48 細胞階段以后；在牛， 816 細胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結構域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道。比如 ， 促性腺激素可誘導神經(jīng)元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達 ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細胞中均有表達 ， 而在那些預定要凋亡 的卵泡的顆粒細胞中卻沒有表達或表達很弱。包囊在卵泡形成時破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時期也是胚胎生殖細胞大量丟失的時期。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動物卵巢內(nèi)的卵原細胞 (oogonia)，持續(xù)進行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級卵母細胞，靜止在第一次減數(shù)分裂的雙線期 [5]。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細胞凋亡現(xiàn)象 ................................................ 1 卵母細胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細胞凋亡分子機理 ............................................ 2 細胞凋亡相關基因 ................................................ 3 胚胎的細胞凋亡 .................................................. 4 細胞凋亡檢測方法 ................................................ 4 形態(tài)學檢測 .................................................... 4 生化檢測 ...................................................... 5 2 實驗研究 ............................................................ 8 實驗方法 ........................................................ 8 口吸撿卵針的準備 .............................................. 8 卵母細胞的準備 ................................................ 8 撿卵及成熟培養(yǎng) ................................................ 8 精子獲能 ...................................................... 9 體外受精 ...................................................... 9 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 ................................................ 9 TUNEL 試劑盒工作原理 ........................................... 9 TUNEL 試劑盒處理前準備工作 .................................... 10 試驗設計 ....................................................... 12 統(tǒng)計分析 ....................................................... 12 結果 ........................................................... 13 試驗一 胚胎發(fā)育各階段細胞凋亡情況 ............................ 13 試驗二 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 ............. 14 試驗三 不同濃度 EGF