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細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響-碩士論(完整版)

2025-02-11 21:09上一頁面

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【正文】 ,但卵母細胞來自性 成熟前小鼠時沒有顯著作用。胱氨酸的攝入對培養(yǎng)條件下細 18 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 胞內保持 GSH 的水平很關鍵 , 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 CYS 在 體 外 培 養(yǎng) 體 系 中 的 促 發(fā) 育 作 用 主 要 是 通 過 GSH 實 現(xiàn) 的 [40,41,42] 。 200uM CYS 在本實驗中對卵 母細胞成熟和胚胎發(fā)育均沒有顯著影響。當用 EGF 處理來源于小 卵泡的牛 COCS 時候,對卵母細胞減數(shù)分裂的進程有促進作用,但對隨后的胚胎發(fā)育 能力 沒有影響。結果表明, 50ng/ml 的 EGF 對牛卵母細胞的成熟有顯著促進作用,而對胚 胎發(fā)育沒有直接影響。 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 很多研究顯示,體外發(fā)育胚胎的細胞凋亡發(fā)生時間比體內發(fā)育胚胎早,而且細 胞凋亡指數(shù)也高,這可能與體外發(fā)育胚胎所處環(huán)境有關。 100uM 濃度的 CYS 對胚胎囊胚率有顯著 提高作用( % 和 %,P),而且其凋亡指數(shù)顯著低于其他組 ( v. ,)。 14 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 試驗二 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 根據(jù)試驗一的結果,胚胎全部培養(yǎng)到第八天,經過固定,通透,抽樣做了 TUNEL 染色,激光共聚焦觀察分析細胞凋亡。 試驗四,卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液添加 EGF 和 CYS 根據(jù)試驗二和試驗三的結果,在成熟液中同時添加 50ng/mlEGF 和 100uMCYS, 并在發(fā)育液中添加 100uMCYS,分析對卵母細胞成熟,胚胎發(fā)育及胚胎細胞凋亡的影 響 。 ( 2)固定和通透。 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 11 PI 復染 PI 是活細胞常用染核染料,能夠精確地結合到經過通透處理的活細胞核上,熒 光顯微鏡下非常清晰地標記出細胞位置,區(qū)別于帶有 FITC 標記的凋亡細胞。 TUNEL 試劑盒處理前準備工作 TUNEL 操作流程總結見圖 1. 胚胎固定 使用 固定液 4%的多聚甲醛,固定收集的各階段胚胎。細胞發(fā)生凋亡的時候,細胞核 內 DNA 會被脫氧核糖核酸內切酶降解成 180200bp 左右長度的寡核苷酸片段,隨后 發(fā)生一系列大分子物質的降解反應,最終形成凋亡小體致使細胞死亡。 取凍精細管一支,置于 37℃ 水浴鍋中 1min,用滅菌吸水紙擦拭凍精細管,剪開 細管封口將解凍的精液緩慢流入已平衡 2h 的含 7ml BO 液 (含 咖啡因 )的 15ml 離心管中, 1800r/5min 分別離心兩次,去掉上清,留下 600800ul 液,用于做體外 受精。g/mLE2 +8181。我們使用的是實驗室常用的第三種獲取卵母細胞的方法。不同用途針直徑不同:撿卵母細胞的針要拉的稍微粗一點,因為 有卵丘細胞層包圍著;最粗的針是移成熟后卵母細胞的針,此時經過成熟培養(yǎng)卵丘 細胞層擴展變松散,使 COCs 的直徑變大,卵丘細胞層的擴展也是卵母細胞成熟的一 個標志;最細的針為移受精后胚胎的針,此時由于精子的活動和精子入卵,使卵丘 細胞層脫落,卵母細胞外圍僅包圍著 12 層卵丘細胞,所以 COCs 直徑較小,此時用 細一點的針可以將胚胎洗的更干凈,擺脫多余精子和雜質的影響,更有利于胚胎的 發(fā)育。 Coskun 等報道 EGF 能顯著提高牛成熟卵母細胞原核形成率,卵裂率及 4~ 8 細胞率。本實驗采用 TUNEL 方法和激光共聚焦顯微鏡結合的 方式檢測細胞凋亡??贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測定核小體單體 和寡聚核小體,因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細胞株或動物組織細胞的凋亡檢測。 近年來隨著熒光定量 PCR 技術的發(fā)展,用定量 PCR 技術檢測基因表達水平更快更準 確。凋亡細胞中提取的 DNA 進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳,并用 EB 進行染色時, 這些大小不同的 DNA 片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 [29]。在細胞凋亡中,染色體 DNA 雙鏈斷裂或單 鏈斷裂而產生大量的粘性 339。 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 5 生化檢測 細胞凋亡的生化特征最主要是 DNA 核小體間的斷裂,產 50300kb 或 180200bp 整數(shù)倍的多聚核苷酸片段,在瓊脂糖凝膠上呈梯形電泳圖譜 (DNA ladder, 1980); 膜結構對稱性喪失,并 PS 顆粒外翻;細胞中具 Caspase3 酶的活性表達;細胞中促 凋亡基因與抗凋亡基因表達等都是重要的生化特征。在物理化學或者人 為誘導的情況下,凋亡發(fā)生的時間可在 EGA 之前。他們證明 BCL2L10 與微管蛋白結合,卵胞質周 圍參與時間特異性重新分配,直接調控腫瘤蛋白和線粒體??沟蛲龅鞍字挥性诘? PH( PH 低于 ) 條件下形成通道的活動 , 這表示在生理條件下也可能存在形成通道的活動。抗凋亡與其他抗凋亡成員間 , 促凋亡和其 他促凋亡成員間 , 還有抗凋亡和促凋亡成員間能夠隨意地互相作用 , 形成二聚體或多聚體。這說明促性腺激素可能通過誘導 NAIP 的表達影響顆粒細胞的存活 , 從而間接影響卵母細胞的凋亡或存活 [22]。這表明 AHR 的基因 水平對于胎兒卵巢發(fā)育過程中卵母細胞凋亡的數(shù)量起著決定性作用??梢姲抑? 的滋養(yǎng)細胞是通過 “自我犧牲 ”凋亡來實現(xiàn)卵母細胞的發(fā)育和成熟的。被忽視死亡 (death by neglect)。這時候生 殖細胞的數(shù)目會急劇下降,絕大多數(shù)發(fā)生死亡。 細胞凋亡是一個凋亡相關多 基因之間相互作用的,眾多蛋白質參與的復雜信號 轉導過程。在體外生產的胚胎發(fā)育過程中,不利的環(huán)境因素會增加細胞凋亡率,因此 細胞凋亡的生物學意義受到了廣泛關注。 CYS 可以提高牛胚胎體外發(fā)育能力。結果表明 EGF 對牛胚胎體外發(fā)育沒有明顯影響。結果表明, 對于牛體外受精胚胎,凋亡信號最早出現(xiàn)于 16 細胞期,隨著胚胎的發(fā)育,凋亡發(fā)生 比率也增加。 16 細 胞凋亡率為 26%,桑葚胚凋亡率為 83%,囊胚為 97%,擴展囊胚和 孵化囊胚為 100%。在胚胎發(fā)育液中添加 100uMCYS 可以明顯提高 胚胎發(fā)育能力,囊胚率顯著高于對照組( v. ,P),囊胚的凋亡指數(shù) 顯著低于其他組 ( v. , P)。( 4)在成熟 液和發(fā)育液中同時添加 EGF 和 CYS 可以提高牛卵母細胞成熟和胚胎的發(fā)育,但不產 生疊加效應。細胞凋亡能表現(xiàn)出一些典型的形態(tài)和生化 特征,在附植前胚胎細胞凋亡評定中也廣泛應用了這些特征。細胞凋亡的分子機制調控方面國內外在體細胞上取得了很多重大成就。在人類中,妊娠 8 周的女性胚胎卵 原細胞就開始增殖,在第 20 周左右達到峰值,由 1000 個左右迅速分裂達到約 700 萬個。因缺陷死亡 (death by defect)。 卵母細胞凋亡分子機理 在胚胎性腺中存在著死亡信號 (TNFα、 Fas 配體等 )和存活信號 (LIF、 kit 配體 等 )。此外 , AHR 對 于多環(huán)芳香烴 [PAHs] ( 一類在環(huán)境如香煙中廣泛存在 , 已知會引起胚胎期雌性生 殖細胞死亡的化學物質 ) 也是一種很好的受體。在這種類型 的閉鎖中 , 可 觀察到顆粒細胞的 DNA 電泳呈典型的凋亡形狀分布。當大部分 成員間隨意作用時 , 死亡促進因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專 一的 ( 比如 Bok 與 Mcl1 間 ) 。脂質體的研究中顯示 , Bclxl 能 4 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關閉,而 Bax 和 Bak 能促進其開啟,這可能使細胞色素 C 的通過。在死亡的卵母細胞, BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位,并且中和 BCL2L10 會加速卵母細胞死亡。 細胞凋亡檢測方法 形態(tài)學檢測 形態(tài)學檢測是依據(jù)細胞凋亡過程中所表現(xiàn)出來的一些形態(tài)學特征來判定凋亡。以下介紹幾種常用生化檢測方 法。OH 末端,而正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的 斷裂,因而沒有 339。而壞死細胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。此外,將 PCR 技術和核酸分子雜交技術相結合,能顯著提高檢測的特異性和靈 敏度。 線粒體膜勢能的檢測 線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不 同的細胞發(fā)生凋亡,而線粒體跨膜電位 DYmt 的下降,被 認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過 程中最早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、 DNA 斷裂)出現(xiàn)之 前,一旦線粒體 DYmt 崩潰,則細胞凋亡不可逆轉。 胚胎細胞凋亡研究展望 在哺乳動物中,雌性生殖細胞的存活與凋亡調控是多因子參與的復雜調節(jié)過程。 Arellano 等的研究結果表明, EGF 能顯著提高豬卵母細胞的體外成熟率。 卵母細胞的準備 卵母細胞的準備:一般情況下,卵母細胞的獲取主要有三種方法。 從屠宰場收集牛的卵巢,放置于 30℃ 滅菌的 %生理鹽水中, 12h 內送到實 驗室。L/mL PS)里清洗 3 遍, 轉入已平衡 2h 以上的 35mm 培養(yǎng)皿的微滴中 (每滴為 100181。 體外受精 將成熟培養(yǎng) 2224h 的卵母細胞取出,用受精液( BO 液 +20ug/ml 肝素鈉)洗三 遍,轉入事先準備好并平衡 2h 以上的受精液滴里, 50ul 液滴放置 20 左右卵母細胞。當末端轉移 酶 TdT 將帶有 FITC 熒光標記的寡核苷酸片段連接到斷裂末端時,在熒光顯微鏡下會 觀察到被熒光標記的細胞,以判斷細胞發(fā)生了凋亡。實際操作如下:將從發(fā)育 液撿取的胚胎用 4%的多聚甲醛洗三遍,再移入多聚甲醛液滴中,固定 12h。 制片并用激光共聚焦觀察 滅菌載玻片上放置 36 個胚胎,四周涂抹中性樹脂膠,輕輕蓋上蓋玻片,裝到 裝片的盒子,放 20℃ 保存,一周之內用激光共聚焦觀察,照相,做統(tǒng)計分析。 ( 3)抽樣做 TUNEL 染色處理,檢測細胞凋亡。 統(tǒng)計分析 所得實驗數(shù)據(jù)如卵裂率,囊胚率使用卡方檢驗分析,確定差異顯著性;胚胎的 凋亡細胞和細胞總數(shù)使用細胞計數(shù)軟件統(tǒng)計;細胞凋亡指數(shù)用 SAS 軟件分析差異性。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細胞數(shù) 卵裂數(shù)( %) 囊胚數(shù)( %) 凋亡指數(shù)( AI) 對照組 240 188( ) b 54( ) c EGF 50 240 208( ) a 83()a ( ng/ml) 100 240 190( ) b 59()c CYS 100 240 193( ) b 70()b (uM) 200 250 189( ) b 55()c 注 : 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細胞總數(shù);囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù);同列數(shù)據(jù)后面標注的不同小寫字母表示 差異顯著( P< ),相同的小寫字母表示差異不顯著( P) 由表得出, 50ng/ml 濃度 EGF 對卵母細胞的卵裂率提高顯著( %和 %, P),從而對囊胚率有顯著影響,凋亡指數(shù)顯著低于對照組( 和 , P)。說明 CYS 對胚胎囊胚率有明顯促進作用,能夠顯著降 低胚胎細胞凋亡。體外發(fā)育跟體內發(fā)育相比, 發(fā)育不同階段缺少關鍵生長因子等導致發(fā)育質量受影響。 在本研究中,在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率,這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結果一致。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高,卵丘細胞能介導 EGF 的 影響,卵丘細胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比,生長因子的正常作用受到限制。 CYS 在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時候,有顯著的促進成熟和發(fā)育 的作用,而且顯著降低胚胎細胞凋亡指數(shù)。 GSH ( glutathione)是谷胱甘肽的縮寫。 CYS 是 GSH 的 前體,低分子量硫醇( thiol)合成半胱胺 ( cysteamine CYS)能減少胱氨酸( cystine)形成半胱氨酸( cysteine)的幾率, 從而在卵母細胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。卵母細胞來自成年母 山羊時,成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進囊胚的發(fā)育,但 100200uM CYS 濃度對性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒有顯著影響。 EGF 促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復和極體的形成,促進卵丘細胞的擴展。 但是 EGF 對來源于羔羊的卵母細胞,只對其成熟有促進作用,而對囊胚率卻沒有影
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