【正文】 ，但卵母細(xì)胞來(lái)自性 成熟前小鼠時(shí)沒(méi)有顯著作用。胱氨酸的攝入對(duì)培養(yǎng)條件下細(xì) 18 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 胞內(nèi)保持 GSH 的水平很關(guān)鍵 ， 為 GSH 的合成提供半胱氨酸。 CYS 在 體 外 培 養(yǎng) 體 系 中 的 促 發(fā) 育 作 用 主 要 是 通 過(guò) GSH 實(shí) 現(xiàn) 的 [40,41,42] 。 200uM CYS 在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)卵 母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育均沒(méi)有顯著影響。當(dāng)用 EGF 處理來(lái)源于小 卵泡的牛 COCS 時(shí)候，對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程有促進(jìn)作用，但對(duì)隨后的胚胎發(fā)育 能力 沒(méi)有影響。結(jié)果表明， 50ng/ml 的 EGF 對(duì)牛卵母細(xì)胞的成熟有顯著促進(jìn)作用，而對(duì)胚 胎發(fā)育沒(méi)有直接影響。 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 很多研究顯示，體外發(fā)育胚胎的細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)間比體內(nèi)發(fā)育胚胎早，而且細(xì) 胞凋亡指數(shù)也高，這可能與體外發(fā)育胚胎所處環(huán)境有關(guān)。 100uM 濃度的 CYS 對(duì)胚胎囊胚率有顯著 提高作用（ % 和 %,P），而且其凋亡指數(shù)顯著低于其他組 ( v. ,)。 14 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 試驗(yàn)二 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過(guò)固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀(guān)察分析細(xì)胞凋亡。 試驗(yàn)四，卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液添加 EGF 和 CYS 根據(jù)試驗(yàn)二和試驗(yàn)三的結(jié)果，在成熟液中同時(shí)添加 50ng/mlEGF 和 100uMCYS， 并在發(fā)育液中添加 100uMCYS，分析對(duì)卵母細(xì)胞成熟，胚胎發(fā)育及胚胎細(xì)胞凋亡的影 響 。 （ 2）固定和通透。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 11 PI 復(fù)染 PI 是活細(xì)胞常用染核染料，能夠精確地結(jié)合到經(jīng)過(guò)通透處理的活細(xì)胞核上，熒 光顯微鏡下非常清晰地標(biāo)記出細(xì)胞位置，區(qū)別于帶有 FITC 標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。 TUNEL 試劑盒處理前準(zhǔn)備工作 TUNEL 操作流程總結(jié)見(jiàn)圖 1. 胚胎固定 使用 固定液 4%的多聚甲醛，固定收集的各階段胚胎。細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)候，細(xì)胞核 內(nèi) DNA 會(huì)被脫氧核糖核酸內(nèi)切酶降解成 180200bp 左右長(zhǎng)度的寡核苷酸片段，隨后 發(fā)生一系列大分子物質(zhì)的降解反應(yīng)，最終形成凋亡小體致使細(xì)胞死亡。 取凍精細(xì)管一支，置于 37℃ 水浴鍋中 1min，用滅菌吸水紙擦拭凍精細(xì)管，剪開(kāi) 細(xì)管封口將解凍的精液緩慢流入已平衡 2h 的含 7ml BO 液 (含 咖啡因 )的 15ml 離心管中， 1800r/5min 分別離心兩次，去掉上清，留下 600800ul 液，用于做體外 受精。g/mLE2 +8181。我們使用的是實(shí)驗(yàn)室常用的第三種獲取卵母細(xì)胞的方法。不同用途針直徑不同：撿卵母細(xì)胞的針要拉的稍微粗一點(diǎn)，因?yàn)? 有卵丘細(xì)胞層包圍著；最粗的針是移成熟后卵母細(xì)胞的針，此時(shí)經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)卵丘 細(xì)胞層擴(kuò)展變松散，使 COCs 的直徑變大，卵丘細(xì)胞層的擴(kuò)展也是卵母細(xì)胞成熟的一 個(gè)標(biāo)志；最細(xì)的針為移受精后胚胎的針，此時(shí)由于精子的活動(dòng)和精子入卵，使卵丘 細(xì)胞層脫落，卵母細(xì)胞外圍僅包圍著 12 層卵丘細(xì)胞，所以 COCs 直徑較小，此時(shí)用 細(xì)一點(diǎn)的針可以將胚胎洗的更干凈，擺脫多余精子和雜質(zhì)的影響，更有利于胚胎的 發(fā)育。 Coskun 等報(bào)道 EGF 能顯著提高牛成熟卵母細(xì)胞原核形成率，卵裂率及 4～ 8 細(xì)胞率。本實(shí)驗(yàn)采用 TUNEL 方法和激光共聚焦顯微鏡結(jié)合的 方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡?？贵w夾心酶聯(lián)免疫分析法可以測(cè)定核小體單體 和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。 近年來(lái)隨著熒光定量 PCR 技術(shù)的發(fā)展，用定量 PCR 技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)水平更快更準(zhǔn) 確。凋亡細(xì)胞中提取的 DNA 進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，并用 EB 進(jìn)行染色時(shí)， 這些大小不同的 DNA 片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 [29]。在細(xì)胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單 鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性 339。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 生化檢測(cè) 細(xì)胞凋亡的生化特征最主要是 DNA 核小體間的斷裂，產(chǎn) 50300kb 或 180200bp 整數(shù)倍的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠上呈梯形電泳圖譜 (DNA ladder， 1980)； 膜結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)性喪失，并 PS 顆粒外翻；細(xì)胞中具 Caspase3 酶的活性表達(dá)；細(xì)胞中促 凋亡基因與抗凋亡基因表達(dá)等都是重要的生化特征。在物理化學(xué)或者人 為誘導(dǎo)的情況下，凋亡發(fā)生的時(shí)間可在 EGA 之前。他們證明 BCL2L10 與微管蛋白結(jié)合，卵胞質(zhì)周 圍參與時(shí)間特異性重新分配，直接調(diào)控腫瘤蛋白和線(xiàn)粒體?？沟蛲龅鞍字挥性诘? PH（ PH 低于 ） 條件下形成通道的活動(dòng) ， 這表示在生理?xiàng)l件下也可能存在形成通道的活動(dòng)?？沟蛲雠c其他抗凋亡成員間 ， 促凋亡和其 他促凋亡成員間 ， 還有抗凋亡和促凋亡成員間能夠隨意地互相作用 ， 形成二聚體或多聚體。這說(shuō)明促性腺激素可能通過(guò)誘導(dǎo) NAIP 的表達(dá)影響顆粒細(xì)胞的存活 ， 從而間接影響卵母細(xì)胞的凋亡或存活 [22]。這表明 AHR 的基因 水平對(duì)于胎兒卵巢發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞凋亡的數(shù)量起著決定性作用?？梢?jiàn)包囊中 的滋養(yǎng)細(xì)胞是通過(guò) “自我犧牲 ”凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟的。被忽視死亡 (death by neglect)。這時(shí)候生 殖細(xì)胞的數(shù)目會(huì)急劇下降，絕大多數(shù)發(fā)生死亡。 細(xì)胞凋亡是一個(gè)凋亡相關(guān)多 基因之間相互作用的，眾多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在體外生產(chǎn)的胚胎發(fā)育過(guò)程中，不利的環(huán)境因素會(huì)增加細(xì)胞凋亡率，因此 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義受到了廣泛關(guān)注。 CYS 可以提高牛胚胎體外發(fā)育能力。結(jié)果表明 EGF 對(duì)牛胚胎體外發(fā)育沒(méi)有明顯影響。結(jié)果表明， 對(duì)于牛體外受精胚胎，凋亡信號(hào)最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生 比率也增加。 16 細(xì) 胞凋亡率為 26%，桑葚胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%,擴(kuò)展囊胚和 孵化囊胚為 100%。在胚胎發(fā)育液中添加 100uMCYS 可以明顯提高 胚胎發(fā)育能力，囊胚率顯著高于對(duì)照組（ v. ,P），囊胚的凋亡指數(shù) 顯著低于其他組 ( v. , P)。（ 4）在成熟 液和發(fā)育液中同時(shí)添加 EGF 和 CYS 可以提高牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育，但不產(chǎn) 生疊加效應(yīng)。細(xì)胞凋亡能表現(xiàn)出一些典型的形態(tài)和生化 特征，在附植前胚胎細(xì)胞凋亡評(píng)定中也廣泛應(yīng)用了這些特征。細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制調(diào)控方面國(guó)內(nèi)外在體細(xì)胞上取得了很多重大成就。在人類(lèi)中，妊娠 8 周的女性胚胎卵 原細(xì)胞就開(kāi)始增殖，在第 20 周左右達(dá)到峰值，由 1000 個(gè)左右迅速分裂達(dá)到約 700 萬(wàn)個(gè)。因缺陷死亡 (death by defect)。 卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理 在胚胎性腺中存在著死亡信號(hào) (TNFα、 Fas 配體等 )和存活信號(hào) (LIF、 kit 配體 等 )。此外 ， AHR 對(duì) 于多環(huán)芳香烴 [PAHs] （ 一類(lèi)在環(huán)境如香煙中廣泛存在 ， 已知會(huì)引起胚胎期雌性生 殖細(xì)胞死亡的化學(xué)物質(zhì) ） 也是一種很好的受體。在這種類(lèi)型 的閉鎖中 ， 可 觀(guān)察到顆粒細(xì)胞的 DNA 電泳呈典型的凋亡形狀分布。當(dāng)大部分 成員間隨意作用時(shí) ， 死亡促進(jìn)因子和死亡抑制因子間的有些相互作用是可能高度專(zhuān) 一的 （ 比如 Bok 與 Mcl1 間 ） 。脂質(zhì)體的研究中顯示 ， Bclxl 能 4 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 刺激 VDAC 的關(guān)閉，而 Bax 和 Bak 能促進(jìn)其開(kāi)啟，這可能使細(xì)胞色素 C 的通過(guò)。在死亡的卵母細(xì)胞， BCL2L10 與促凋亡 BAX 共定位，并且中和 BCL2L10 會(huì)加速卵母細(xì)胞死亡。 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 形態(tài)學(xué)檢測(cè)是依據(jù)細(xì)胞凋亡過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的一些形態(tài)學(xué)特征來(lái)判定凋亡。以下介紹幾種常用生化檢測(cè)方 法。OH 末端，而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有 DNA 的 斷裂，因而沒(méi)有 339。而壞死細(xì)胞 DNA 電泳后則呈模糊的 涂片狀。此外，將 PCR 技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合，能顯著提高檢測(cè)的特異性和靈 敏度。 線(xiàn)粒體膜勢(shì)能的檢測(cè) 線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不 同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線(xiàn)粒體跨膜電位 DYmt 的下降，被 認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò) 程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、 DNA 斷裂）出現(xiàn)之 前，一旦線(xiàn)粒體 DYmt 崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。 胚胎細(xì)胞凋亡研究展望 在哺乳動(dòng)物中，雌性生殖細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控是多因子參與的復(fù)雜調(diào)節(jié)過(guò)程。 Arellano 等的研究結(jié)果表明， EGF 能顯著提高豬卵母細(xì)胞的體外成熟率。 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：一般情況下，卵母細(xì)胞的獲取主要有三種方法。 從屠宰場(chǎng)收集牛的卵巢，放置于 30℃ 滅菌的 %生理鹽水中， 12h 內(nèi)送到實(shí) 驗(yàn)室。L/mL PS)里清洗 3 遍， 轉(zhuǎn)入已平衡 2h 以上的 35mm 培養(yǎng)皿的微滴中 (每滴為 100181。 體外受精 將成熟培養(yǎng) 2224h 的卵母細(xì)胞取出，用受精液（ BO 液 +20ug/ml 肝素鈉）洗三 遍，轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好并平衡 2h 以上的受精液滴里， 50ul 液滴放置 20 左右卵母細(xì)胞。當(dāng)末端轉(zhuǎn)移 酶 TdT 將帶有 FITC 熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段連接到斷裂末端時(shí)，在熒光顯微鏡下會(huì) 觀(guān)察到被熒光標(biāo)記的細(xì)胞，以判斷細(xì)胞發(fā)生了凋亡。實(shí)際操作如下：將從發(fā)育 液撿取的胚胎用 4%的多聚甲醛洗三遍，再移入多聚甲醛液滴中，固定 12h。 制片并用激光共聚焦觀(guān)察 滅菌載玻片上放置 36 個(gè)胚胎，四周涂抹中性樹(shù)脂膠，輕輕蓋上蓋玻片，裝到 裝片的盒子，放 20℃ 保存，一周之內(nèi)用激光共聚焦觀(guān)察，照相，做統(tǒng)計(jì)分析。 （ 3）抽樣做 TUNEL 染色處理，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 統(tǒng)計(jì)分析 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如卵裂率，囊胚率使用卡方檢驗(yàn)分析，確定差異顯著性；胚胎的 凋亡細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)；細(xì)胞凋亡指數(shù)用 SAS 軟件分析差異性。 表 3 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine oocytes maturation 添加因子 濃度 卵母細(xì)胞數(shù) 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對(duì)照組 240 188（ ） b 54（ ） c EGF 50 240 208（ ） a 83()a （ ng/ml） 100 240 190（ ） b 59()c CYS 100 240 193（ ） b 70()b (uM) 200 250 189（ ） b 55()c 注 ： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細(xì)胞總數(shù)；囊胚率 =囊胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫(xiě)字母表示 差異顯著（ P＜ ），相同的小寫(xiě)字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， 50ng/ml 濃度 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞的卵裂率提高顯著（ %和 %， P），從而對(duì)囊胚率有顯著影響，凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組（ 和 ， P）。說(shuō)明 CYS 對(duì)胚胎囊胚率有明顯促進(jìn)作用，能夠顯著降 低胚胎細(xì)胞凋亡。體外發(fā)育跟體內(nèi)發(fā)育相比， 發(fā)育不同階段缺少關(guān)鍵生長(zhǎng)因子等導(dǎo)致發(fā)育質(zhì)量受影響。 在本研究中，在成熟液中添加 EGF 顯著提高了牛卵母細(xì)胞成熟受精后的卵裂率 和囊胚率，這與 Guler 和 GrazulBilska 等的研究結(jié)果一致。 EGF 在小卵泡中的濃度比大卵泡的濃度高，卵丘細(xì)胞能介導(dǎo) EGF 的 影響，卵丘細(xì)胞數(shù)較少的羔羊與成年羊相比，生長(zhǎng)因子的正常作用受到限制。 CYS 在卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液均添加的時(shí)候，有顯著的促進(jìn)成熟和發(fā)育 的作用，而且顯著降低胚胎細(xì)胞凋亡指數(shù)。 GSH （ glutathione）是谷胱甘肽的縮寫(xiě)。 CYS 是 GSH 的 前體，低分子量硫醇（ thiol）合成半胱胺 （ cysteamine CYS）能減少胱氨酸（ cystine）形成半胱氨酸（ cysteine）的幾率， 從而在卵母細(xì)胞成熟液添加 CYS 能增加 GSH 的合成。卵母細(xì)胞來(lái)自成年母 山羊時(shí)，成熟液添加 200uM 的 CYS 能促進(jìn)囊胚的發(fā)育，但 100200uM CYS 濃度對(duì)性 成熟前的山羊體外發(fā)育卵裂率和囊胚發(fā)育率沒(méi)有顯著影響。 EGF 促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)和極體的形成，促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展。 但是 EGF 對(duì)來(lái)源于羔羊的卵母細(xì)胞，只對(duì)其成熟有促進(jìn)作用，而對(duì)囊胚率卻沒(méi)有影