【正文】 GSH 是由三個氨基酸組成的短肽，細胞內(nèi)促進 糖，脂肪，蛋白質(zhì)的代謝。很多研究顯 示 [32,33]， CYS 能夠增加牛和綿 羊的卵母細胞質(zhì)內(nèi) GSH 的水平，從而對胚胎發(fā)育有促進作用。很多 研究顯示 [33,34]，生長因子調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的主要原因是通過卵丘細胞發(fā)揮作用。他們的研究結(jié)果顯示， EGF 對來源于 FSH 處理過的成年母羊的卵母細胞成熟率及囊胚率均有顯著提高作用。當(dāng)胚胎中某些細胞的發(fā)育 受到影響，不利于整個胚胎的發(fā)育時，這些細胞會啟動凋亡相關(guān)基因，使細胞死亡。 試驗四 EGF 和 CYS 對牛卵母細胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的 影響 根據(jù)試驗二和試驗三的結(jié)果，選取 EGF 的有效濃度 50ng/ml 和 CYS 的有效濃度 100uM,分別在卵母細胞成熟液和胚胎發(fā)育液都添加。說明 EGF 對卵母細胞成熟有促進作用，此作用影響以后的發(fā)育。 胚胎凋亡率是發(fā)生細胞凋亡現(xiàn)象的胚胎在試驗胚胎總數(shù)所占的比率。設(shè)置陰性，陽性對照。 收集的胚胎 BSA/DPBS 漂洗 陽性對照： 實 驗 組 ： 陰性對照： DNase 處理 40min TUNEL ： L TUNEL： L 9ul 9ul+E 1ul TUNEL ： Label 液 9ul+Enzyme 1ul BSA/DPBS 漂洗 RNase 處理： RNase+RNA buffer， 40min BSA/DPBS 漂 洗 PI 復(fù)染 BSA/DPBS 漂洗 制片 顯微鏡觀察照 相 圖 1 胚胎細胞凋亡檢測過程 Fig 1 . Detecting procedure of embryo cell apoptosis 12 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 試驗設(shè)計 卵母細胞成熟液： M199+10%FBS+10181。 胚胎通透 使用通透液 %的 TritonX100 通透胚胎 2h，同時在搖床上輕搖其通透效果更 好，染色時胚胎著色徹底且均勻。此研究中我們使用了普通熒光 顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡分別觀察照相并分析了發(fā)生凋亡的胚胎細胞。 將離心完成的含有精子的獲能液每滴加 50ul，受精液滴終體積為 100ul。L 成熟培養(yǎng) 液，放 20 枚 COCs)，用胚胎級礦物油覆蓋，然后在 ℃ ， 5%CO2 和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2224h。用滅菌的 37℃ 生理鹽水將卵巢洗 34 遍，用配有 12 號針頭的 10ml 注射器抽 吸卵巢上 26mm 大小卵泡內(nèi)的 COCs，將抽取的卵泡液收集于 50ml 離心管中，整個 抽卵過程中卵巢置于 37℃ 恒溫水浴鍋里，保證溫度。第一種方法 是通過對供體雌性動物進行超排卵，獲得比正常排卵較多的卵母細胞。 Merlo 等培養(yǎng)貓卵母細胞時發(fā)現(xiàn)，盡管 EGF 對卵母細胞胞核成熟沒有顯著影響，但 卻能顯著提高卵裂率和囊胚率。 大約 90%的未成熟卵母細胞能在體外達到核成熟，并有 80%能經(jīng)歷受精、卵裂并發(fā)育 到 2 細胞階段，然而 發(fā)育到囊胚階段的僅達到 40%，要遠遠低于體內(nèi)受精后的囊胚 發(fā)育率。線粒體跨膜電位的存在，使一些 親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 12 Tetrechlorotetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC1)、 Tetramethyl rhodaminemethyl ester(TMRM)等可結(jié) 合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低 ，從而 判定凋亡與否。 ELISA 法分析組蛋白 細胞發(fā)生凋亡時， Ca2+、 Mg2+依賴 性內(nèi)源核酸內(nèi)切酶被激活，在核小體連接區(qū)切 開雙鏈 DNA，產(chǎn)生帶有單個或寡聚核小體的 DNA 片段。絕大多數(shù)凋亡細胞中 DNA 的斷裂都表現(xiàn)出這種典型特征。OH 形成。 磷脂酰絲氨酸外翻分析（ Annexin V）法 磷脂酰絲氨酸（ Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋 亡的早期 PS 可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征為細胞收縮變圓，與鄰接細胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮， 核染色質(zhì)固縮，聚集在核膜下，呈邊界分明的顆粒狀或新月形小體，進而核裂解成 質(zhì)膜包繞的碎片，胞膜突出形成質(zhì)膜小泡，脫落后形成細胞凋亡小體 (apoptosis body)。他們提出， BCL2L10 是與卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育存活能力相關(guān)的重要的新的候選因子。然而， 此通道在其開啟狀態(tài)下也不夠大到能讓細胞色素 C 通過。促凋亡成員按結(jié)構(gòu)也可分為多結(jié)構(gòu)域蛋白和 BH3 單結(jié) 構(gòu)域蛋白。卵泡閉鎖的另一 種類型是源于卵母細胞自身的凋亡 ， 組織型纖溶酶激活因子 (tPA)蛋白介導(dǎo)的蛋白水 解作用可能參與了卵母細胞的自身瓦解和清除過程。培養(yǎng)于含有 PAHs 的培養(yǎng)液中的鼠胚 卵巢將會有異常多的生殖細胞發(fā)生凋 亡 ， 但這種凋亡可通過加入 AHR 的頡抗物 α 萘黃酮 (ANF)而被阻止。在這些信號的作用下 ,凋亡主要通過 caspases、 Bcl2 等蛋白質(zhì)家族的相互作 [16] 用來實現(xiàn)。自我犧牲 死亡(death by self sacrifice)[12,13]。在妊娠 6 個月時就己經(jīng)開始發(fā)生卵泡閉鎖，卵母細胞數(shù)目急劇下降， 大量退 化[6,7]，并一直持續(xù)不斷，結(jié)果使卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量大大減少，出生時約 80%的卵泡退 化，青春期卵泡數(shù)量減少 95%[7,8]。 細胞凋亡是一個比較保守的機制，不管在體細胞還是在胚胎細胞，其分子調(diào)控機制 是相通的。 1965 年 Lockshin 和 Williams 首次發(fā)現(xiàn)了細胞凋亡現(xiàn)像，由 Kerr 等人在 1972 年首次對凋亡進行了形態(tài) 學(xué)描述，并作為一種特殊的細胞死亡類型確定下來。 關(guān)鍵詞： 牛；體外受精胚胎；細胞凋亡；細胞因子 Effect of Cytokines on Cell Apoptosis of Bovine In Vitro Fertilized(IVF) Embryos Abstract In this study, development of oocyte and embryo of bovine were examined after epidermal growth factor (EGF) and cysteamine (CYS) were supplemented in in vitro maturation medium and embryo culture medium, cell apoptosis of embryo under different treatment conditions were detected using TUNEL fluorescence method. The purpose of this study is to improve bovine oocyte maturation and embryo development. The results are as follows: In experiment one, cell apoptosis of bovine in vitro fertilized embryo at different developmental stages were detected. The results showed that apoptosis signal first appeared in the 16cell stage, and apoptosis rates was increased with embryo development. The apoptosis rate was 26% in 16cell embryo, 83% in morula , 97% in blastocysts and 100% in expanded blastocysts and hatching blastocysts. In blastocysts stage, cell apoptosis index were increased with embryo development(apoptosis index was in blastocysts, in expanded blastocysts, in hatched blastocysts ) In experiment two, the effects of EGF or CYS on bovine oocytes maturation were pared. The results showed that 50ng/ml EGF added in maturation medium could improve oocytes maturation which increased the cleavage rate of oocyte significantly. CYS supplemented in maturation medium did not influence oocyte cleavage rate and blastocyst rate ,but apoptosis index in 50ng/ml EGF or 100uM CYS treatment groups were significantly lower than that of control group(, ,P), which indicate supplementation with appropriate concentrations of EGF or CYS could improve the development of bovine oocyte significantly. In experiment three, the effect of EGF or CYS on bovine embryo development were pared. The results showed that EGF did not effect bovine embryo development. Supplement with 100uM CYS in culture medium could increase blastocyst rate significantly to pare to control group( v. ， P).Apoptosis index of blastocyst in 100uM CYS were significantly lower than that of other groups ( V. ,P). This result indicate CYS can promote the bovine embryo development. In experiment four, the effects of EGF bined with CYS on bovine oocyte maturation and embryo development were result showed that supplementation with EGF and CYS together did not produce additive effects on bovine oocyte maturation and embryo development. These results suggest that (1)in bovine IVF embryo, the apoptosis signal first appeared in the 16cell stage. Apoptosis rate was increased with embryo development. (2) EGF and CYS could promote oocyte maturation. (3)EGF had no significant effect on embryo development。說明 CYS 對牛胚 胎體外發(fā)育有明顯促進作用。在囊胚階段，細胞凋亡指數(shù)也隨發(fā)育進行呈現(xiàn)上升趨勢（囊胚凋 亡指數(shù)為 ，擴展囊胚為 , 孵化囊胚為 ）。研究結(jié)果如下： 試驗一，研究了牛體外受精胚胎在不同發(fā)育階段的細胞凋亡情況。 試驗三，比較了在牛胚胎發(fā)育液