【正文】 5 EGF 和 CYS 對牛卵母細(xì)胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of EGF and CYS in bovine oocytes maturation and IVF embryo development M199 CR1 卵母細(xì)胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 180 141（ ） b41（ ） c E+ C+ C+ 180 158（ ） a64（ ） a E+ C C+ 180 159（ ） a 66（ ） a E C C+ 180 144（ ） b 52（ ） b 注： 同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示差異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P）； E 表示 EGF， C 表示 CYS， +表示添加， 表示沒添加 16 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 由表得出，成熟液添加 EGF（ 50ng/ml） ,同時(shí)在發(fā)育液添加 CYS（ 100uM），可以 提高牛卵母細(xì)胞受精后的卵裂率和囊胚率，這進(jìn)一步說明 EGF 對成熟有促進(jìn)作用。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細(xì)胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 100 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細(xì)胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對胚胎囊胚率沒有影響。 100uM 濃 度的 CYS 對卵母細(xì)胞卵裂率 沒有顯著影響，但隨后的胚胎囊胚率有顯著的提高 （ %和 %,P），說明 CYS 對卵母細(xì)胞的成熟有一定促進(jìn)作用，只是在 囊胚階段表現(xiàn)出來。 16 細(xì)胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)比 8d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低，實(shí)驗(yàn)中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。凋亡指數(shù)（ AI） 是胚胎發(fā)生凋亡的細(xì)胞在胚胎細(xì)胞總數(shù)所占的比率。 試驗(yàn)三，胚胎發(fā)育液添加不同濃度 EGF（ 0， 50,100ng/ml）和 CYS（ 0,100,200uM） (1) 發(fā)育液添加 EGF（ 0， 50,100ng/ml） (2) 發(fā)育液添加 CYS（ 0,100,200uM） 與試驗(yàn)一相同處理過程，分析對胚胎發(fā)育及胚胎細(xì)胞凋亡的影響。 （ 4）用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡。 試驗(yàn)一，比較牛不同發(fā)育階段胚胎細(xì)胞凋亡情況 （ 1）胚胎體外受精完成后，收集 2細(xì)胞， 3細(xì)胞， 4細(xì)胞， 8細(xì)胞， 16細(xì)胞， 桑椹胚，囊胚，擴(kuò) 展囊胚及孵化囊胚。g/mLFSH+10181。 RNAase 處理 實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組，陽性對照組三組做完 TUNEL 處理后，在 RNase+ RNAbuffer 中處理 40min，降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 RNA，去除干擾。 設(shè)置各對照組 （ 1） TUNEL 陽性對照 為避免出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，設(shè)置陽性對照。 在 TUNEL 操作中，移胚胎的玻璃針勤換，以免在實(shí)驗(yàn)組，陰性對照，陽性對照 中造成交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 TUNEL 試劑盒平時(shí)在 20℃ 凍存。 TUNEL 試劑盒工作原理 TUNEL 試劑盒（ Roche）含有酶液和熒光標(biāo)記液。將培養(yǎng)皿 放回 ℃ ,5% CO2 恒溫培養(yǎng)箱共孵育 6h。精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，核膜溶解，染色質(zhì)去致密化，同時(shí)刺 激卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，排出第二極體完成受精。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 9 通常根據(jù) COCs 的卵胞質(zhì)和卵丘細(xì)胞形態(tài)，將 COCs 分為四級： A 級 COCs 為卵胞 質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞層完整且 3 層以上； B 級 COCs 為卵胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞 3 層以內(nèi) 或部分脫落； C 級為裸露的卵母細(xì)胞； D 級為退化的卵母細(xì)胞。g/mLLH+1181。全部卵巢的卵泡液抽完將離心 管靜止 20min 左右，讓卵母細(xì)胞沉淀，去掉一半上清 卵泡液，將含有沉下的卵母細(xì) 胞的剩下卵泡液倒入滅菌培養(yǎng)皿，并放在恒溫電熱平板，準(zhǔn)備撿卵。第一 和第二種方法主要由于操作程序復(fù)雜，成本較 高或者因受動(dòng)物機(jī)體發(fā)育季節(jié)的影響 而在國內(nèi)較少使用。此法多用于 小鼠，家兔，山羊，綿羊等小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 8 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 2 實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)方法 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 將玻璃細(xì)管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細(xì)管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時(shí)候根據(jù)手感迅速向兩側(cè)拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。半胱胺（ CYS）是一種含有硫醇成分的谷胱甘肽（ GSH） 前體，能夠在卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合 體（ COCs）內(nèi)合成 GSH 并提高其含量。在各 種生長因子中， EGF 在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中應(yīng)用較 多， EGF 是顆粒細(xì)胞強(qiáng)有力的分裂素，也可能是卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的一種信號 因子。采取有效檢測方法確定卵母細(xì)胞和胚胎的凋亡機(jī)制，對提高體外授精的囊 胚率有重要意義。目前對凋亡 細(xì)胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學(xué)檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細(xì)胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 7 Caspase3 活性的檢測 Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 Caspase3 是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能?？啥繙y 定細(xì)胞凋亡，無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標(biāo)記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應(yīng)。而核小體 DNA 與中心組蛋白 H2A， H2B， H3 和 H4 緊密結(jié)合，又可以防止核酸內(nèi)切酶的切割作用，故產(chǎn)生的 DNA 片段是 180～ 200 bp 的整數(shù)倍，并在凋亡細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達(dá)水平的比例，根據(jù)其比例分析細(xì)胞是存活還是凋亡。 6 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 PCR 技術(shù)檢測 在細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究中，發(fā)現(xiàn)了很多表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的 表達(dá)水平也是檢測細(xì)胞凋亡的一種方法。經(jīng) 這些內(nèi)切酶切割使核小體間斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數(shù) 15 倍。該方法可用細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、載玻片上的粘連細(xì) 胞、冰凍組織或石蠟包埋組織為 檢測標(biāo)本，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的 衍生物標(biāo)記到 DNA 的 339。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報(bào)道了該方法。 AnnexinV 是一種分子量為 35～ 36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋 白，能與 PS 高親和 力特異性結(jié)合。目前一般都通過生化檢測方法來判斷。這種死亡過程不發(fā)生溶酶體、線粒體及細(xì)胞膜破裂，沒 有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄， 故不引起炎癥反應(yīng)。如在小鼠， 2細(xì)胞階段以后；在人和豬， 48 細(xì)胞階段以后；在牛， 816 細(xì)胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細(xì)胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。 胚胎的細(xì)胞凋亡 根據(jù)研究，體外培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)培養(yǎng)的胚胎相比，細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)間更早， 且凋亡數(shù)量更多。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進(jìn)化上保守的途徑。 Bax 和 Bak 需要結(jié)合到 VDAC 并使其形成一個(gè)巨大通道才能釋放細(xì)胞色素 C。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道。除了 BH3 特有結(jié)構(gòu)域促凋亡成員外其他成員間的相互作用的意義還沒有 確定。其中抗凋亡成員包括 （ Bcl2, BclXl, Bclw, AL, Mcl1, DIVA/BOO, NR13） ,促凋亡成員包括 （ Bax, BclXs,Bclrambo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。在很多中途發(fā)生閉鎖的卵泡中 ， 卵母細(xì)胞中 tPA 活性很高 ， 而健康卵泡的卵母細(xì)胞則 tPA 活性很低。比如 ， 促性腺激素可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達(dá) ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞中均有表達(dá) ， 而在那些預(yù)定要凋亡 的卵泡的顆粒細(xì)胞中卻沒有表達(dá)或表達(dá)很弱。免疫化學(xué)試驗(yàn)表明 ， 凋亡開始之前 ， 暴露于 PAHs 的胚胎卵 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 巢生殖細(xì)胞中有 Bcl2 家族促凋亡成員 Bax 蛋白的聚集 ； 相反 ， 與 ANF 共培養(yǎng)則會(huì) 抑制 Bax 蛋白的表達(dá)。近來一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn) , 有一種叫芳香烴受體 (AHR)的胞質(zhì)受體 ,其基因突變可減輕小鼠胚胎的卵母細(xì)胞凋亡 , 這樣的小鼠在出生時(shí) ,其體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量是正常小鼠的兩倍。敲除這些基因就會(huì)改變原始卵泡的儲(chǔ)備量 。包囊在卵泡形成時(shí)破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細(xì)胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時(shí)期也是胚胎生殖細(xì)胞大量丟失的時(shí)期。被忽視死 亡 ， 是指因不能從環(huán)境中得到足夠 的存活因子而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。 卵母細(xì)胞凋亡假說 為什么會(huì)有如此巨大比例的雌性生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡 ？ 人們目前提出了三種學(xué)說 來解釋。而在其它哺乳動(dòng)物中，同等比例的生殖細(xì)胞也會(huì) 在卵子發(fā)生的過程中退化閉鎖。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動(dòng)物卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞 (oogonia)，持續(xù)進(jìn)行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級卵母細(xì)胞，靜止在第一次減數(shù)分裂的雙線期 [5]。本文通過牛體外受精胚胎培養(yǎng)體系中添加不同細(xì)胞因子，在細(xì)胞層面上 研究其對胚胎早期發(fā)育各個(gè)階段細(xì)胞凋亡的影響，對體外受精技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供更 多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。前者是從形態(tài)學(xué)角度提出的概念，而后者是從發(fā)育學(xué)角度提 出的概念。同年 Brenner 將細(xì)胞凋亡跟基 因調(diào)控聯(lián)系了起來。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 ................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理 ............................................ 2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 ................................................ 3 胚胎的細(xì)胞凋亡 .................................................. 4 細(xì)胞凋亡檢測方法 ................................................ 4 形態(tài)學(xué)檢測 .................................................... 4 生化檢測 ...................................................... 5 2 實(shí)驗(yàn)研究 ............................................................ 8 實(shí)驗(yàn)方法 .................