【正文】 中添加不同濃度 EGF 或 CYS 的效果。（ 3） EGF 對(duì)牛胚胎體外發(fā)育沒有明顯影響。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 ................................................ 1 卵母細(xì)胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細(xì)胞凋亡分子機(jī)理 ............................................ 2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 ................................................ 3 胚胎的細(xì)胞凋亡 .................................................. 4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 ................................................ 4 形態(tài)學(xué)檢測(cè) .................................................... 4 生化檢測(cè) ...................................................... 5 2 實(shí)驗(yàn)研究 ............................................................ 8 實(shí)驗(yàn)方法 ........................................................ 8 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 .............................................. 8 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 ................................................ 8 撿卵及成熟培養(yǎng) ................................................ 8 精子獲能 ...................................................... 9 體外受精 ...................................................... 9 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 ................................................ 9 TUNEL 試劑盒工作原理 ........................................... 9 TUNEL 試劑盒處理前準(zhǔn)備工作 .................................... 10 試驗(yàn)設(shè)計(jì) ....................................................... 12 統(tǒng)計(jì)分析 ....................................................... 12 結(jié)果 ........................................................... 13 試驗(yàn)一 胚胎發(fā)育各階段細(xì)胞凋亡情況 ............................ 13 試驗(yàn)二 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟的影響 ............. 14 試驗(yàn)三 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛 體外受精胚胎發(fā)育的影響 .......... 15 試驗(yàn)四 EGF 和 CYS 對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的影響 . 15 討論 ........................................................... 16 胚胎各階段凋亡現(xiàn)象 ........................................... 16 EGF 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 16 CYS 對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 17 結(jié)論 ........................................................... 18 致 謝 .............................................................. 19 參 考 文 獻(xiàn) ........................................................ 20 附 圖 ................................................................................................................................ 24 作 者 簡(jiǎn) 介 ...................................................................................................................... 33 0 略 語(yǔ) 表 FSH(Follicle Stimulating Hormone) 促卵泡素 LH (Luteinizing Hormone) 促黃體素 E2 (Estradiol) 雌二醇 FBS (Fetal Bovine Serum) 胎牛血清 ICM（ inner cell mass） 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) TE（ Trophectoderm） 滋養(yǎng)層細(xì)胞 AI（ Apoptosis index） 凋亡指數(shù) PBS (Phosphate Buffered Saline) 磷酸緩沖液 EGF(Epidermal growth factor) 表皮生長(zhǎng)因子 CYS(Cysteamine) 半胱胺 PS(PenicillinStreptomycin) 青 鏈霉素雙抗 TUNEL(terminaldeoxynucleotidyl 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端 transferase mediated nick end labeling) 標(biāo)記法 DNase I(Deoxyribonuclease) 脫氧核糖核酸酶 I RNase A(Ribonuclease A) 核糖核酸酶 A PI(Propidium iodide) 碘化丙啶 PVP (Pohyvinylpyrolidone) 聚乙烯吡咯烷酮 COCs (Cumulus Oocyte Complexes) 卵丘細(xì)胞 卵母細(xì)胞復(fù)合體 GSH（ Glutathione） 谷胱甘肽 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 引言 細(xì)胞凋亡可以在很多哺 乳動(dòng)物胚胎的附植前發(fā)育過程觀察到，它參與細(xì)胞增殖 和孕體的形成過程，起到清除不正常和功能失常細(xì)胞的作用，并表現(xiàn)出進(jìn)化上的保 守機(jī)制。前者是從形態(tài)學(xué)角度提出的概念，而后者是從發(fā)育學(xué)角度提 出的概念。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動(dòng)物卵巢內(nèi)的卵原細(xì)胞 (oogonia)，持續(xù)進(jìn)行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級(jí)卵母細(xì)胞，靜止在第一次減數(shù)分裂的雙線期 [5]。 卵母細(xì)胞凋亡假說 為什么會(huì)有如此巨大比例的雌性生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡 ？ 人們目前提出了三種學(xué)說 來解釋。包囊在卵泡形成時(shí)破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細(xì)胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時(shí)期也是胚胎生殖細(xì)胞大量丟失的時(shí)期。近來一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn) , 有一種叫芳香烴受體 (AHR)的胞質(zhì)受體 ,其基因突變可減輕小鼠胚胎的卵母細(xì)胞凋亡 , 這樣的小鼠在出生時(shí) ,其體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量是正常小鼠的兩倍。比如 ， 促性腺激素可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達(dá) ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞中均有表達(dá) ， 而在那些預(yù)定要凋亡 的卵泡的顆粒細(xì)胞中卻沒有表達(dá)或表達(dá)很弱。其中抗凋亡成員包括 （ Bcl2, BclXl, Bclw, AL, Mcl1, DIVA/BOO, NR13） ,促凋亡成員包括 （ Bax, BclXs,Bclrambo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。 Antonsson 發(fā)現(xiàn) [25]， 抗凋亡和促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質(zhì) 體膜上可形成通道。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進(jìn)化上保守的途徑。如在小鼠， 2細(xì)胞階段以后；在人和豬， 48 細(xì)胞階段以后；在牛， 816 細(xì)胞階段以后 ,而且體內(nèi)發(fā)育 條件下細(xì)胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。目前一般都通過生化檢測(cè)方法來判斷。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報(bào)道了該方法。經(jīng) 這些內(nèi)切酶切割使核小體間斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數(shù) 15 倍。又如 RTPCR 被用 來檢測(cè) Bcl2 和 Bax 基因表達(dá)水平的比例，根據(jù)其比例分析細(xì)胞是存活還是凋亡?？啥繙y(cè) 定細(xì)胞凋亡，無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標(biāo)記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應(yīng)。目前對(duì)凋亡 細(xì)胞的檢測(cè)常規(guī)采用形態(tài)學(xué)檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細(xì)胞儀 檢測(cè)法、 TUNEL 及 ELISA 法等。在各 種生長(zhǎng)因子中， EGF 在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中應(yīng)用較 多， EGF 是顆粒細(xì)胞強(qiáng)有力的分裂素，也可能是卵母細(xì)胞成熟分裂恢復(fù)的一種信號(hào) 因子。 8 細(xì)胞因子對(duì)牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 2 實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)方法 口吸撿卵針的準(zhǔn)備 將玻璃細(xì)管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細(xì)管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時(shí)候根據(jù)手感迅速向兩側(cè)拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。第一 和第二種方法主要由于操作程序復(fù)雜，成本較 高或者因受動(dòng)物機(jī)體發(fā)育季節(jié)的影響 而在國(guó)內(nèi)較少使用。g/mLLH+1181。精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，核膜溶解，染色質(zhì)去致密化，同時(shí)刺 激卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，排出第二極體完成受精。 TUNEL 試劑盒工作原理 TUNEL 試劑盒（ Roche）含有酶液和熒光標(biāo)記液。 在 TUNEL 操作中，移胚胎的玻璃針勤換，以免在實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照 中造成交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 RNAase 處理 實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組三組做完 TUNEL 處理后，在 RNase+ RNAbuffer 中處理 40min，降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 RNA，去除干擾。 試驗(yàn)一，比較牛不同發(fā)育階段胚胎細(xì)胞凋亡情況 （ 1）胚胎體外受精完成后，收集 2細(xì)胞， 3細(xì)胞， 4細(xì)胞， 8細(xì)胞， 16細(xì)胞， 桑椹胚，囊胚，擴(kuò) 展囊胚及孵化囊胚。 試驗(yàn)三，胚胎發(fā)育液添加不同濃度 EGF（ 0， 50,100ng/ml）和 CYS（ 0,100,200uM） (1) 發(fā)育液添加 EGF（ 0， 50,100ng/ml） (2) 發(fā)育液添加 CYS（ 0,100,200uM） 與試驗(yàn)一相同處理過程，分析對(duì)胚胎發(fā)育及胚胎細(xì)胞凋亡的影響。 16 細(xì)胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)比 8d 囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低，實(shí)驗(yàn)中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細(xì)胞 卵裂數(shù)（ %） 囊胚數(shù)（ %） 凋亡指數(shù)（ AI） 對(duì)照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 10