【正文】 中添加不同濃度 EGF 或 CYS 的效果。（ 3） EGF 對牛胚胎體外發(fā)育沒有明顯影響。 Reproduction） 目 錄 1 引言 ................................................................ 1 卵母細胞凋亡現象 ................................................ 1 卵母細胞凋亡假說 ................................................ 2 卵母細胞凋亡分子機理 ............................................ 2 細胞凋亡相關基因 ................................................ 3 胚胎的細胞凋亡 .................................................. 4 細胞凋亡檢測方法 ................................................ 4 形態(tài)學檢測 .................................................... 4 生化檢測 ...................................................... 5 2 實驗研究 ............................................................ 8 實驗方法 ........................................................ 8 口吸撿卵針的準備 .............................................. 8 卵母細胞的準備 ................................................ 8 撿卵及成熟培養(yǎng) ................................................ 8 精子獲能 ...................................................... 9 體外受精 ...................................................... 9 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 ................................................ 9 TUNEL 試劑盒工作原理 ........................................... 9 TUNEL 試劑盒處理前準備工作 .................................... 10 試驗設計 ....................................................... 12 統(tǒng)計分析 ....................................................... 12 結果 ........................................................... 13 試驗一 胚胎發(fā)育各階段細胞凋亡情況 ............................ 13 試驗二 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛卵母細胞成熟的影響 ............. 14 試驗三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛 體外受精胚胎發(fā)育的影響 .......... 15 試驗四 EGF 和 CYS 對牛卵母細胞成熟和體外受精胚胎發(fā)育發(fā)育的影響 . 15 討論 ........................................................... 16 胚胎各階段凋亡現象 ........................................... 16 EGF 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 16 CYS 對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 ............................ 17 結論 ........................................................... 18 致 謝 .............................................................. 19 參 考 文 獻 ........................................................ 20 附 圖 ................................................................................................................................ 24 作 者 簡 介 ...................................................................................................................... 33 0 略 語 表 FSH(Follicle Stimulating Hormone) 促卵泡素 LH (Luteinizing Hormone) 促黃體素 E2 (Estradiol) 雌二醇 FBS (Fetal Bovine Serum) 胎牛血清 ICM（ inner cell mass） 內細胞團 TE（ Trophectoderm） 滋養(yǎng)層細胞 AI（ Apoptosis index） 凋亡指數 PBS (Phosphate Buffered Saline) 磷酸緩沖液 EGF(Epidermal growth factor) 表皮生長因子 CYS(Cysteamine) 半胱胺 PS(PenicillinStreptomycin) 青 鏈霉素雙抗 TUNEL(terminaldeoxynucleotidyl 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端 transferase mediated nick end labeling) 標記法 DNase I(Deoxyribonuclease) 脫氧核糖核酸酶 I RNase A(Ribonuclease A) 核糖核酸酶 A PI(Propidium iodide) 碘化丙啶 PVP (Pohyvinylpyrolidone) 聚乙烯吡咯烷酮 COCs (Cumulus Oocyte Complexes) 卵丘細胞 卵母細胞復合體 GSH（ Glutathione） 谷胱甘肽 內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文 1 1 引言 細胞凋亡可以在很多哺 乳動物胚胎的附植前發(fā)育過程觀察到，它參與細胞增殖 和孕體的形成過程，起到清除不正常和功能失常細胞的作用，并表現出進化上的保 守機制。前者是從形態(tài)學角度提出的概念，而后者是從發(fā)育學角度提 出的概念。 在胚胎發(fā)育階段，雌性動物卵巢內的卵原細胞 (oogonia)，持續(xù)進行活躍的有絲分裂， 不斷增殖，最后形成初級卵母細胞，靜止在第一次減數分裂的雙線期 [5]。 卵母細胞凋亡假說 為什么會有如此巨大比例的雌性生殖細胞發(fā)生凋亡 ？ 人們目前提出了三種學說 來解釋。包囊在卵泡形成時破裂 ， 那些行使滋養(yǎng)功能的附屬生殖 細胞全部 “自 我犧牲 ”， 而這一時期也是胚胎生殖細胞大量丟失的時期。近來一項新的研究發(fā)現 , 有一種叫芳香烴受體 (AHR)的胞質受體 ,其基因突變可減輕小鼠胚胎的卵母細胞凋亡 , 這樣的小鼠在出生時 ,其體內原始卵泡的數量是正常小鼠的兩倍。比如 ， 促性腺激素可誘導神經元凋亡抑制 蛋白 (NAIP)的表達 ， NAIP 在發(fā)育卵泡的顆粒細胞中均有表達 ， 而在那些預定要凋亡 的卵泡的顆粒細胞中卻沒有表達或表達很弱。其中抗凋亡成員包括 （ Bcl2, BclXl, Bclw, AL, Mcl1, DIVA/BOO, NR13） ,促凋亡成員包括 （ Bax, BclXs,Bclrambo, Bak, Bad, Bok, Bik, Bid, Bim/Bod, Bik/Nbk, Hrk, Bmf, Nix, PUMA, Noxa, BNip3） 等。 Antonsson 發(fā)現 [25]， 抗凋亡和促凋亡多結構域蛋白相互作用 ， 在體外人工脂質 體膜上可形成通道。研究揭露出從卵子傳 遞到合子的一種進化上保守的途徑。如在小鼠， 2細胞階段以后；在人和豬， 48 細胞階段以后；在牛， 816 細胞階段以后 ,而且體內發(fā)育 條件下細胞凋亡是 EGA 之后發(fā)生的。目前一般都通過生化檢測方法來判斷。 TUNEL 法 該 方 法 稱 為 脫 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 轉 移 酶 介 導 的 缺 口 末 端 標 記 法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated niek end labeling， TUNEL)， 1992 年 Gavrieli 等首先報道了該方法。經 這些內切酶切割使核小體間斷裂，產生大小不同的片段，但都是 180～ 200 bp 的整 數 15 倍。又如 RTPCR 被用 來檢測 Bcl2 和 Bax 基因表達水平的比例，根據其比例分析細胞是存活還是凋亡?？啥繙y 定細胞凋亡，無需預先標記細胞，所用抗體不具有種屬特異性， POD 標記的抗 DNA 抗體可與單鏈和雙鏈的 DNA 起反應。目前對凋亡 細胞的檢測常規(guī)采用形態(tài)學檢查和 DNA 電泳分析，更靈敏的方法可采用流式細胞儀 檢測法、 TUNEL 及 ELISA 法等。在各 種生長因子中， EGF 在卵母細胞成熟培養(yǎng)中應用較 多， EGF 是顆粒細胞強有力的分裂素，也可能是卵母細胞成熟分裂恢復的一種信號 因子。 8 細胞因子對牛體外受精胚胎細胞凋亡的影響 2 實驗研究 實驗方法 口吸撿卵針的準備 將玻璃細管在酒精燈上均勻 的加熱滅菌，然后在細管的中間位置或者一邊上集 中加熱，等玻璃管明顯變軟的時候根據手感迅速向兩側拉直，斷開，并在酒精燈上 烤平針尖和針尾。第一 和第二種方法主要由于操作程序復雜，成本較 高或者因受動物機體發(fā)育季節(jié)的影響 而在國內較少使用。g/mLLH+1181。精子進入卵母細胞后，核膜溶解，染色質去致密化，同時刺 激卵母細胞恢復減數分裂，排出第二極體完成受精。 TUNEL 試劑盒工作原理 TUNEL 試劑盒（ Roche）含有酶液和熒光標記液。 在 TUNEL 操作中，移胚胎的玻璃針勤換，以免在實驗組，陰性對照，陽性對照 中造成交叉污染，影響實驗結果的準確性。 RNAase 處理 實驗組，陰性對照組，陽性對照組三組做完 TUNEL 處理后，在 RNase+ RNAbuffer 中處理 40min，降解細胞質內的 RNA，去除干擾。 試驗一，比較牛不同發(fā)育階段胚胎細胞凋亡情況 （ 1）胚胎體外受精完成后，收集 2細胞， 3細胞， 4細胞， 8細胞， 16細胞， 桑椹胚，囊胚，擴 展囊胚及孵化囊胚。 試驗三，胚胎發(fā)育液添加不同濃度 EGF（ 0， 50,100ng/ml）和 CYS（ 0,100,200uM） (1) 發(fā)育液添加 EGF（ 0， 50,100ng/ml） (2) 發(fā)育液添加 CYS（ 0,100,200uM） 與試驗一相同處理過程，分析對胚胎發(fā)育及胚胎細胞凋亡的影響。 16 細胞凋亡率為 26%，桑椹胚凋亡率為 83%，囊胚為 97%，擴展囊胚和孵化囊胚凋亡率為 100% 由表 2 得出， 7d 囊胚細胞凋亡指數比 8d 囊胚細胞凋亡指數顯著低，實驗中觀 察到發(fā)育速度快胚胎形態(tài)和發(fā)育能力都比發(fā)育 速度慢胚胎好。 表 4 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 Effect of different concentrations of EGF or CYS on bovine IVF embryo development 添加因子濃度 卵母細胞 卵裂數（ %） 囊胚數（ %） 凋亡指數（ AI） 對照組 230 185（ ） a 54（ ） b EGF（ ng/ml） 50 230 186（ ） a 57（ ） b 10