【正文】 0 230 182（ ） a 53（ ） b CYS(uM) 100 230 187（ ） a 71（ ） a 200 230 181（ ） a 52（ ） b 注： 卵裂率 =卵裂數(shù)除以卵母細(xì)胞總數(shù)；囊胚率 =囊 胚數(shù)除以卵裂數(shù)；同列數(shù)據(jù)后面標(biāo)注的不同小寫字母表示差 異顯著（ P＜ ），相同的小寫字母表示差異不顯著（ P） 由表得出， EGF 對胚胎囊胚率沒有影響。 討論 本實(shí)驗(yàn)的目的是在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加不同細(xì)胞因子， 從卵裂率，囊胚率，囊胚細(xì)胞凋亡指數(shù)等參數(shù)來分析，細(xì)胞因子 EGF 和 CYS 對卵母 細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影響。 EGF 對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 有報(bào)道表明低濃度的 EGF（ 1,5,25ng/ml）對牛胚胎早期發(fā)育沒有顯著影響 [31]， 在本研究中比較了兩個(gè)較高濃度 EGF（ 50,100ng/ml）對牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育 的影響。 這種差異現(xiàn)象可能跟卵母細(xì)胞的供體卵泡環(huán)境有關(guān) [32]。 CYS 對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響 在本研究中，添加 100uM CYS 對卵母細(xì)胞的成熟有一定促進(jìn)作用，但是卵裂率 上沒有顯著表現(xiàn)出來，而在囊胚率上表現(xiàn)為提高效應(yīng)。 CYS 在成熟液添加，對卵裂和囊胚沒有顯著作用而能夠促進(jìn)孵化率的作用 機(jī)制目前還有待繼續(xù)研究。 GSH 的合成通過 γ谷氨 酰循環(huán) （ γgluta。這些發(fā)現(xiàn)顯示， CYS 對卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影 響，均與卵母細(xì)胞的供體物種和成熟狀態(tài)有 關(guān)。 EGF 的受體超家族之一的 erbB3 的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎 2細(xì)胞階段存在，而 4到 16 細(xì)胞階段不存 在，但在囊胚階段重新被檢測到。在成年母牛 和小牛，成熟液添加 EGF 顯著提高卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率。體外發(fā)育胚胎可通過改善培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化培養(yǎng)體系來提高胚胎的質(zhì)量，推遲凋 亡出現(xiàn)的時(shí)間。成熟液加 EGF，發(fā)育液加 CYS 時(shí)對胚胎囊胚率產(chǎn)生了非 常顯著的促進(jìn)作用 (%,%和 %,P),且這兩組凋亡指數(shù)也顯著低于 對照組（ , 和 ， P0,05），說明添加 EGF 和 CYS 能夠顯著改善胚胎 發(fā)育質(zhì)量。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 15 試驗(yàn)三 不同濃度 EGF 或 CYS 對牛體外受精胚胎發(fā)育的影響 根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，胚胎全部培養(yǎng)到第八天，經(jīng)過固定，通透，抽樣做了 TUNEL 染色，激光共聚焦觀察分析細(xì)胞凋亡。 內(nèi)蒙古 農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 13 結(jié)果 試驗(yàn)一 胚胎發(fā)育各階段細(xì)胞凋亡情況 胚胎體外受精完成后，收集 2細(xì)胞， 3細(xì)胞， 4細(xì)胞， 8細(xì)胞， 16細(xì)胞，桑 椹胚，囊胚，擴(kuò)展囊胚及孵化囊胚，固定和通透以后隨機(jī)抽樣做 TUNEL 染色處理， 用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡。比較不同 發(fā)育階段囊胚（囊胚，擴(kuò)張囊胚，孵化囊胚）之間的胚胎細(xì)胞凋亡情況。g/mLE2 +8181。 （ 2） TUNEL 陰性對照 為檢測熒光標(biāo)記是否標(biāo)上，作陰性對照，隨機(jī)挑選 23 個(gè)通透好的胚胎，用 TUNEL 處理時(shí)不加酶液，只在標(biāo)記液中處理 12h。具體操作如下：在冰上的多孔板里做一個(gè) 9ul 的帶有 FITC 熒光的寡核苷酸標(biāo)記液微滴，蓋上礦物油（避免在 ℃ 培 養(yǎng)箱孵育時(shí)操作液 的蒸發(fā)），迅速加 1ul 的 TdT 酶液，充分混合兩種物質(zhì)，標(biāo)記液和酶液比例為 9:1， 然后快速將準(zhǔn)備好的胚胎放入微滴中，將多孔板放到 ℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱孵育 12h。 胚胎培養(yǎng)及發(fā)育 卵母細(xì)胞做完體外受精后，培養(yǎng) 48h 后換半液。 精子獲能 哺乳動(dòng)物釋放的 精子不能立即使卵子受精，必須在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)停留一段 時(shí)間才能獲得受精能力，此過程為精子獲能。L PS）中沖洗 3 遍，然后在成 熟培養(yǎng)液 (M199+10%FBS+10181。在家畜采卵一般經(jīng)過體外成熟才能 受精。有些研究顯示， CYS 對卵母細(xì) 胞的成熟沒有影響但能夠促進(jìn)囊胚率和孵化囊胚率。 Coskun 和 Erickson 等的研究表明，表皮生長因子（ EGF）、胰島素樣生長因子 （ IGF）、轉(zhuǎn)移生長因子 (TGF)等生長因子都能不同程度地促進(jìn)小鼠、大鼠、牛、豬、 倉鼠等卵母細(xì)胞的體外成熟。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞， Caspase3 的活性明顯下降。通過酶標(biāo)測定儀分析，即可定量反映細(xì)胞凋亡 的水平。 如 LMPCR 被用來擴(kuò)增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 DNA 片段。原位 TUNEL 法快速， 其反應(yīng)全過程僅需約 3 h，其靈敏度及特異性都較高，尤其適用于作有關(guān)細(xì)胞凋亡 與相關(guān)基因表達(dá)關(guān)系方面的研究。碘 化丙啶（ Propidine iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在 凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞， PI 能夠透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。一般認(rèn)為，凋亡小 體幾分鐘即可形成，被吞噬的凋亡小體可在細(xì)胞內(nèi)存留數(shù)小時(shí) [28]。動(dòng)物受精后 胚胎基因組并不是立即轉(zhuǎn)錄表達(dá)的，而是先表達(dá)母源基因組，再表達(dá)胚胎基因組?？沟蛲鲱? Bcl2 蛋白可以通過阻止促凋亡蛋白在線粒體膜上形成低聚體來發(fā)揮其抗凋亡作用 [26]。 此外 ， 當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí) BH3 單結(jié)構(gòu)域蛋白 Bim 水平提高 ， 而 Mcl1 和 Bik 水平保持不 變。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 近年來 , Bcl2 基因蛋白家族作用機(jī)制方面進(jìn)行了大量研究 ,對其已有了一定的 了解 ,并提出了幾種作用模式 ,但確切的機(jī)制尚未確定。胚胎時(shí)期生殖細(xì)胞的大量丟失與 成體中發(fā)生的卵泡閉鎖雖然本質(zhì)上都是細(xì)胞凋亡 ， 但它們遵循 的卻是不同的調(diào)控機(jī) 制。二是激活的 caspase8 將引起 Bcl2 家族中促凋亡成員 Bid 的裂解 , 從而破壞線粒體 ,使其釋放包括細(xì)胞色素 C 在內(nèi)的多種凋亡發(fā)生因子 ,促進(jìn)凋亡體 (包含有 Apaf1 和 caspase9 酶原 )的形成 ,最終引發(fā)凋亡 [16,17]， 此途徑也成為線粒 體途徑。因缺陷死亡理 論認(rèn)為 ， 凋亡能除去減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生配對錯(cuò)誤或重組異常的卵母細(xì)胞 ， 即體內(nèi)存在 一個(gè)監(jiān)控機(jī)制 ， 可發(fā)現(xiàn)并除去有缺陷的卵母細(xì)胞 ， 而保留能正常進(jìn)行減數(shù)分裂的卵 母細(xì)胞來形成原始卵泡 。 De Pol[10] 等采用原位末端標(biāo)記技術(shù) (TUNEL)，觀察到了懷孕 1820 周的人類胚胎卵巢內(nèi)典型的 2 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì) 胞凋亡的影響 凋亡細(xì)胞形態(tài) ， 并且還證實(shí) ， 這個(gè)時(shí)期的胚胎中只有生殖細(xì)胞發(fā)生了凋亡 ， 發(fā) 生凋亡的生殖細(xì)胞比率約為 8%。在許多無脊椎動(dòng)物和脊 椎動(dòng)物中，大量的生殖細(xì)胞在發(fā)育的不同階段丟失 [1,2]。這三位科 學(xué)家因秀麗新桿線蟲模式中細(xì)胞凋亡的卓越成就而分享了 2022 年諾貝爾生理或醫(yī) 學(xué)獎(jiǎng)。 Cell Apoptosis。 以上結(jié)果表明，（ 1）牛體外受精胚胎，凋亡信號最早出現(xiàn)于 16 細(xì)胞期，隨著胚 胎的發(fā)育，凋亡發(fā)生比率也增加。說明 EGF 對卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用。 分類號 S823 學(xué)校代碼 10129 U D C636 學(xué) 號 08202209 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 Effect of Cytokines on Cell Apoptosis of Bovine In Vitro Fertilized(IVF) Embryos 申 請 人：蘇米雅 學(xué)科門類：農(nóng) 學(xué) 學(xué)科專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖 研究方向：動(dòng)物繁殖生物學(xué)與繁殖技術(shù) 指導(dǎo)教師：張家新 教 授 論文提交日期： 二〇一一年五月 0 要 本研究通過在牛卵母細(xì)胞成熟液和胚胎發(fā)育液中添加不同濃度的表皮生長因子 （ EGF）和半胱胺（ CYS），比較其對牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的影響，利用 TUNEL 檢測法，檢測了不同處理?xiàng)l件下胚胎細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明 50ng/ml EGF 顯著提高卵母細(xì)胞的卵裂率。結(jié)果表明，同時(shí)添加 EGF 或 CYS 對牛卵母細(xì)胞的成熟及胚胎的發(fā)育沒有產(chǎn)生疊 加效應(yīng)。 In Vitro Fertilized Embryo。此后 Brenner,Horvitz,Sulston 等科學(xué)家繼續(xù)研究細(xì)胞凋亡的 分子機(jī)制，并描述了 Bcl2 家族， P53 等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。 卵母細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 卵母細(xì)胞與其他類型細(xì)胞一樣，也在不斷地退化死亡。 Ratts[9]等在懷孕 天之后的鼠胚卵巢細(xì)胞中， 證實(shí)了其 DNA 被切割為 180200bp 不同倍數(shù)的片段，電泳呈梯狀條帶分布。這方面的證據(jù)多來自于對小鼠的研究 。 Fas 配體與卵母細(xì)胞上的 Fas 受體結(jié)合 ,可能激活 caspase8 前體 ,因此打開了誘導(dǎo) 卵母細(xì)胞凋亡的兩個(gè)途徑 : 一個(gè)途徑是產(chǎn)生高水平的 caspase8,直接啟動(dòng) caspase 效應(yīng)分子的級聯(lián)反應(yīng) ， 也稱 為死亡受體途徑 ?？梢娛笈呗殉仓械穆涯讣?xì)胞在暴露于 PAHs 后 ， 是通過一個(gè) AHR 依賴的方式增加 Bax 的表達(dá)來促發(fā)凋亡的 [19]。 tPA 與顆粒細(xì) 胞中表達(dá)的抑制素 α 相互作用 ， 可能對卵泡破裂、成熟卵子的釋放和未成熟卵子的 閉鎖均起作用。有人發(fā)現(xiàn) [23]， 凋亡的誘導(dǎo)不依賴于 P53 抑制劑 ， 而是依賴于 Bak 或者 Bax。 由上可見 ,Bax 對于細(xì)胞色素 C 的釋放起著關(guān)鍵的作用，在凋亡信號的刺激下 Bax 可從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上 ,從而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。體外培養(yǎng)環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的物理化學(xué)因素刺激或者培 養(yǎng)液缺乏胚胎所需的一些重要細(xì)胞因子或激素都是造成此現(xiàn)象的原因。凋亡小體很快被噬細(xì)胞或鄰接細(xì)胞所吞噬。 AnnexinV 進(jìn)行熒光素（ FITC、 PE）或生物素標(biāo)記，以標(biāo)記了的 AnnexinV 作為熒光探針利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。OH 末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。 PCR 即是檢測這些特異性基因的常用方法。 該法是利用 “夾心定量酶標(biāo)免疫測定法 ”的原理，用抗組蛋白－生物素和抗 DNA－ 過氧化物酶（ POD）分別結(jié)合到核小體的組蛋白和 DNA 成分上，洗滌除去未結(jié)合的抗 體后，加入 POD 底物產(chǎn)生顏色反 應(yīng)。 Caspase3 通常以 酶原（ 32 KD16）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的 Caspase3 由兩個(gè)大亞基（ 17KD）和兩個(gè)小亞基（ 12 KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最 終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這對家畜進(jìn)行體外受精并規(guī)模化生產(chǎn)以及瀕危動(dòng)物的人工繁殖等 都非常有意義。據(jù)研究， CYS 能夠細(xì)胞質(zhì)成熟，在體外受精中促進(jìn)雄原核的形成。第二種方法是借助超聲波探測儀，內(nèi)窺 鏡等直接從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體卵巢中抽取卵母細(xì)胞。 撿卵及成熟培養(yǎng) 在體視顯微鏡下，挑選卵胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞層完整且至少有 35 層以上的 COCs （卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合體），在洗卵液（ PBS+2%FBS+10181。一般撿取 A,B 級卵母 細(xì)胞用于體外成熟及體外受精。 6h 后，將受精后胚胎撿起，用發(fā)育液（ CR 1）洗三遍，放入提前配好并平衡 2h 以上的發(fā)育液里，也是 20 個(gè) /100ul 微滴規(guī)格 。使用時(shí)整個(gè)操作過程需在冰上且暗環(huán)境里完 10 細(xì)胞因子對牛體外受精胚胎細(xì)胞凋亡的影響 成，以保證末端轉(zhuǎn)移酶活性。隨機(jī)選出 23 個(gè)通透好的胚胎，先用 DNase+DNAbuffer 中處理 40min，再用 TUNEL 試劑盒處理。g/mLLH+1181。 檢測胚胎發(fā)育不同階段細(xì)胞凋亡情況，分析胚胎細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)間。典型的凋亡細(xì)胞為既有 TUNEL 陽性標(biāo)記的生化特征，又有細(xì)胞核致密化或者碎片化的形態(tài)學(xué)特征。 50ng/ml 濃度 EGF 和 100uM 濃度 CYS 處理組凋亡指數(shù)顯著低于 對照組(, 和 ， P)，說明成熟液添加適當(dāng)濃度 EGF 或 CYS 能 夠顯著降低胚胎細(xì)胞凋亡。 CYS 對牛體外受精胚胎的發(fā)育有明顯的 促進(jìn)作用，囊胚發(fā)育率明顯高于對照組的 （ %和 %， P）。這種差異可能是由于不同的培養(yǎng)體系所造成 的。在山羊，卵母細(xì)胞來源 于羔羊時(shí)，用 EGF 單獨(dú)或與 CYS 共處理卵母細(xì)胞，對成 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 17 熟沒有顯著影響；而對來源于成年母羊的卵母細(xì)胞，存活率顯著提高。 EGF 對受精后 4細(xì)胞期胚胎的發(fā)育沒有影響 [31]，對囊胚發(fā)育上也沒有顯著效果。 De Matos [35]等研究發(fā)現(xiàn)， 卵母細(xì)胞來自成年小鼠時(shí)，胚胎發(fā)育中， CYS 能促進(jìn)囊胚發(fā)育