【正文】 。但許多哺乳動物類細(xì)胞中外源基因的表達(dá)需要內(nèi)含子存在，如果在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)外源基因時，最好用基因組基因而非cDNA。 命名原則：屬 —— 種 —— 株 —— 分離序號 例如： EcoRⅠ 屬： Escherichia 種： coli 株： R 分離序號：Ⅰ 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二，第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 。 ③ cDNA 文庫的建立與基因的分離 :是以 mRNA 為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補 DNA 的方法。 : ① 有很高的拷貝數(shù)； ② 強大的啟動子，可保證外源基因的高效表達(dá)； ③ 可保證糖基化。小不同的外源性目的基因、載體分子量要小 ,載力要大 。 IPTG 是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。 ： 所謂基因組文庫是將基因組 DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組 DNA片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組 DNA 的所有序列。 : 利用抗原 抗體反應(yīng)來檢測含目的基因的重組轉(zhuǎn)化體或嗜斑的技術(shù)稱為免疫分析法。 ） ： 與同裂酶對應(yīng)的一類限制酶，它們雖來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱為同尾酶。 ： 是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。 植物細(xì)胞融合過程如何？融合特點是什么？ 融合過程： ①凝聚作用階段，其間兩個或兩個以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； ②在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋； ③由于細(xì)胞質(zhì) 橋的擴展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。 （由莖尖、腋芽、生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 3 原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生） （ 2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。特點：可以定點觀察；分離單細(xì)胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢； ③ 看護培養(yǎng) ： 指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。 1植物細(xì)胞脫分化 ： 離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過程。 綠島法 ： 在植株上使葉面細(xì)胞產(chǎn)生突變并創(chuàng)造選擇壓力，令抗性突變細(xì)胞正常生長形成綠色斑點，謂之“綠島”，其為突變細(xì)胞，分散和培養(yǎng)后可得完整植株 植物原生質(zhì)體 ： 除去纖維素外壁且具有生活力的裸體植物細(xì)胞 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑 ： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進而長成完整植株。 細(xì)胞平板培養(yǎng)： 將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法 器官發(fā)生途徑 ： 離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑 (葡萄糖硫酸鉀、 MES、 CaCl?2H2O、 KH2PO4 等 ). 植物原生質(zhì)體制備需要的酶：纖維素酶和果膠酶 常用的生長素有 _ 吲哚乙酸 ___、 _萘乙酸 ___、 _2,4D__ 、 _吲哚丁酸 __等，常用的細(xì)胞分裂素 __激動素 __ 、 __6芐基氨基嘌呤 __、 _玉米素 _ 由愈傷組織再生植株有兩條途徑： 一步成苗 （ 原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗 ）和 兩步法成苗 （ 即首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗 ） 四、 問答題 植物細(xì)胞實驗室培養(yǎng)方法有哪幾種？ ① 液體淺層培養(yǎng)法 ： 將懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞過濾得到游離單細(xì)胞和小細(xì)胞團，培養(yǎng)在淺層液體培養(yǎng)基中。用途：主要用來觀察細(xì)胞生長、分裂、形成 細(xì)胞團的過程。這一階段同不定芽方式一樣。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。如果在目的基因兩側(cè)加 polydA，則在載體兩側(cè)加 polydT。由許多限制酶切點組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的 DNA 序列。 基因工程中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組 DNA 分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細(xì)胞稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。 基因工程操作中的轉(zhuǎn)化是泛指將重組 DNA 轉(zhuǎn)入宿主中的方法。 當(dāng)它 的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新 的DNA 分子，而易于連接重組。 表達(dá)系統(tǒng)中常用的強啟動子 Lac Trp λ PL λ PR 基因制備方法 ①基因分離的物理方法 ； ②鳥槍法；③ cDNA 文庫的建立與基因分離；④基因組文庫法；⑤基因的化學(xué)合成；⑥聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（ PCR）。如 DNA 分子中某段的 G≡ C 堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（ Tm）就高。 ⑤ 基因的化學(xué)合成 :優(yōu)點 : 。 cDNA鏈的合成 。② mRNA的 5′ 端與 3′ 端的正確加工，提高 mRNA 的穩(wěn)定性 。 :一般來講：①質(zhì)?？?貝數(shù)多，基因表達(dá)水平高；②表達(dá)質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性與基因高效表達(dá) 。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在 5?OH和 3‘ –OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。 ： 是人工構(gòu)建的，含有λ DNA 的粘性 (cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體 DNA 載體雙重性質(zhì)的特殊載體。 酶工程 ：指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和 DNA 重組技術(shù)改善自然酶的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中進行應(yīng)用的技術(shù) ，試對各種方法進行綜合比較 ？ ① 吸附法 ： 分為物理吸附法及離子交換劑吸附法。 缺點： 固定化酶只適用于小分子底物及小分子產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，不適用于催化大分子底物或產(chǎn)物的反應(yīng)。 此法便于自動控制、反應(yīng)條件恒定、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，所以適用于連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，但處理雜菌污染比較困難 ，抗體酶的優(yōu)點有哪些？ 專一性和穩(wěn)定性更強、催化作用機制不同、能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng) ？ 誘導(dǎo)法、引入法、拷貝法 、 抗體庫法 微生物工程 一、 專業(yè)符號 生化需氧量 化學(xué)需氧量 紫外線 快中子 聚乙二醇 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽 代謝通量分析 代謝控制分析 二、 名詞解釋 （ Microbial Engineering） 利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)，是生物工程的重要組成部分 利用微生物 在一定條件下自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株，能達(dá)到純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)的目的 有意識的將微生物暴露于物理的、化學(xué)的或生物的誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程 有些葡萄糖的分解產(chǎn)物，雖然不導(dǎo)致 pH 下降，但它能阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所必需的酶的形成或酶的活性，即發(fā)生葡萄糖效應(yīng) 這種經(jīng)微生物生理作用 (代謝 )后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源 (如硫酸銨 )稱為生理酸性物質(zhì) 性物質(zhì) 經(jīng)菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的無機氮源 (如硝酸鈉 )稱為生理堿性物質(zhì) 在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構(gòu)成抗生素分子結(jié)構(gòu)的一部生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 13 分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)沒有大的變化，這些物質(zhì)稱為抗生素的前體。 物理誘變因子 、 化學(xué)誘變劑 和 生物誘變劑 。 細(xì)菌或放線菌： 蔗糖、丁二酸鈉 酵母菌： 山梨醇、甘露醇 霉菌： KCl、 NaCl 一定濃度的 Ca2+、 Mg2+等二價陽離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，高滲培養(yǎng)基中不可缺少 PEG 和 Ca2+分別起什么作用？ PEG 可使原生質(zhì)體的膜電位下降，然后，原生質(zhì)體通過 Ca2+離子交聯(lián)而促進凝集。 堿基類似物誘發(fā)基因突變可導(dǎo)致堿基對的轉(zhuǎn)換，這種誘變易產(chǎn)生回復(fù)突變。 貼壁依賴性（錨地依賴性）： 大多數(shù)動物細(xì)胞只能附著或貼在固體或半固體表面上培養(yǎng)才能生長 原代細(xì)胞培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）： 直接從機體取材（細(xì)胞，組織或 器官）并置于體外條件生長到第一次移植繼代培養(yǎng)。 1細(xì)胞融合： 在外力作用下，兩個或兩個以上異源動物細(xì)胞合并 為一個多核細(xì)胞，同時表達(dá)兩者或兩者以上細(xì)胞有益性狀，繼續(xù)培養(yǎng)，多核細(xì)胞核融合成為單核融合細(xì)胞（雜種細(xì)胞） 的過程，亦稱為動物體細(xì)胞雜交技術(shù)。 人源化抗體 : 將小鼠抗體分子的 可變區(qū)或 互補決定區(qū)序列移植到人抗體可變區(qū)框架中而制成的抗體。 無血清培養(yǎng)基中加入的補充因子 —— 細(xì)胞生長因子與激素； B .特殊因子 —— 促貼壁因子（纖粘連因子，層粘連因子）； 保存動物種質(zhì)細(xì)胞最有效的方法 ? 超低溫冰凍法： 70℃以下冰箱或液氮（ 196℃）長期 超低溫法常用保護劑 及機理 ？ 保護劑：二甲亞砜 DMSO，濃度 %；甘油 5%20%。 優(yōu)點： ① 簡便，可靠性與重復(fù)性好； ② 分離混雜細(xì)胞的優(yōu)良方法； ③ 可用于建立細(xì)胞株，分離細(xì)胞變種； ④ 評價藥物及毒物對細(xì)胞生長的影響； ⑤ 篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤制備單克隆抗體 淋巴細(xì)胞雜交瘤的形成原理是什么？為什么 HAT培養(yǎng)基可用于篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤？ 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 20 原理： 體外能無限增值的骨髓瘤細(xì)胞（ HGPRT或 TK— ） 與能分泌抗體的小鼠脾 B 淋巴細(xì)胞融合，制備雜種細(xì)胞。 簡述制備雜交瘤生產(chǎn) McAb 的工藝路線？ ：小鼠骨髓瘤細(xì)胞，人或鼠免疫淋巴細(xì)胞； b 細(xì)胞融合：免疫脾淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞用 PEG 融合； c 雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化培養(yǎng)： ① HAT 選擇系統(tǒng)篩選雜交瘤細(xì)胞； ②檢測含特定抗體的陽性克隆 —— 酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA，放射免疫法 RIA，免疫熒光法； ③克隆化培養(yǎng) —— 有限稀釋法； d 單克隆抗體的大量生產(chǎn)： 體外培養(yǎng)法 —— 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管；體內(nèi)培養(yǎng)法 —— 實體瘤法和腹水的制備； ：常用硫酸銨沉淀法，超濾法，鹽析法生物技術(shù)復(fù)習(xí)思考題 07437 21