【正文】 共一百三十頁。 ? 與人類有關的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌〔 ETEC〕、致病性大腸桿菌〔 EPEC〕、出血性大腸桿菌〔 EHEC〕、侵襲性大腸桿菌〔 EIEC〕、黏附性大腸桿菌〔 EAEC〕。 菌名 菌落形態(tài) 傷寒沙門氏菌 黑色 ， 有金屬光澤 鼠傷寒沙門氏菌 黑色 ， 有金屬光澤 奇異變形桿菌 褐色或呈黑色 ， 無金屬光澤 弗氏志賀氏菌 棕色至綠色 大腸埃希氏菌 棕色至綠色 糞鏈球菌 50071 44104 Blank 50115 第二十三頁，共一百三十頁。 d：傷寒沙門氏菌不產(chǎn)氣 e：亞利桑那亞型腸炎沙門氏菌為乳糖陽性或陰性反應，但通常 β牛乳糖反應陽性。 ? 商品化的生化快速檢定系統(tǒng)：如 API系統(tǒng)、 R/B系統(tǒng)、腸管(enterotube)系統(tǒng)等。多由鼠傷寒、豬霍亂及腸炎沙門氏菌引起。 生化特性： ? 絕大多數(shù)沙門氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。 ? 它是引起食物感染與食物中毒的重要致病菌，是最常見的食源性疾病的病原微生物。包括沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、變形桿菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、空腸彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、單核細胞增生李斯特菌等。 第一節(jié) 食物中毒概述 ? ? 第四頁，共一百三十頁。 內(nèi)容提要 ? 沙門氏菌檢測 ? ? 副溶血性弧菌 ? ? 志賀氏菌 ? ? 肉毒梭菌 ? 第三頁，共一百三十頁。 ? 發(fā)病率高且集中，人與人之間不直接傳染 ? 發(fā)病與進食同類食物有明顯的因果關系 食物中毒的特征 第七頁，共一百三十頁。 ?I 沙門氏菌屬 ? 1880年 E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌， 1885年 Salmon與Smith又別離出豬霍亂沙門氏菌，以后取 Salmon氏之名為本菌屬之名。 ? ： 35~37℃ 培養(yǎng) 18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊 ? ：沙門氏菌不分解乳糖，形成無色或淺粉紅色、半透明的圓形菌落。 中毒的原因 中毒的機理 ? 一般來說，當沙門氏菌隨食物進入消化道后，可在小腸和結(jié)腸內(nèi)繼續(xù)繁殖，附于腸黏膜或侵入黏膜下層，引起腸黏膜的充血、水腫、組織炎癥，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進入血液，出現(xiàn)菌血癥，引起全身感染。 ? 防止食品原料和成品被污染 ? 控制生長繁殖 ? 食前徹底加熱殺菌 第十六頁，共一百三十頁。 ISO6579 沙門氏菌檢驗流程 第二十頁，共一百三十頁。 ISO—— 中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。 沙門氏菌檢驗 —— 幾點注意 ? ? ? ? 第二十六頁，共一百三十頁。大腸菌群數(shù)的上下，說明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。 大腸桿菌的生物學特性 培養(yǎng)特性： ? 大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。 ? 對常用消毒劑抵抗力不強， 5％～ 10％漂白粉、 3％來蘇兒、 5％石炭酸等均能迅速殺死大腸桿菌。只有食品中活菌數(shù)在 107cfu/g以上，才可使人致病。 第三十六頁，共一百三十頁。 第三十七頁，共一百三十頁。 2h 查 MPN表報告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種 EMB平板〔 35℃ 、 18~24h〕 〔大腸菌群〕 從 EMB平板上挑取 5個可疑菌轉(zhuǎn)接到 PCA斜 面，進行革蘭氏染色、 IMVC生化鑒定、接 種 LST復檢產(chǎn)氣 查 MPN表報告結(jié)果〔大腸桿菌〕 第三十八頁，共一百三十頁。 ? 2〕初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。 大腸桿菌測定 —— EMB選擇性別離鑒別 ? EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長； ? 高壓滅菌可使得美藍復原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復原有的正常紫色，傾注平板前應先搖勻； ? 大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤； ? 該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應在避光條件。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保存初染時的顏色。 某些細菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚； 將對二甲基氨基苯甲醛參加細菌蛋白胨水培養(yǎng)液中，吲哚 與試劑中的對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，呈紅色反響，形成 玫瑰吲哚，為吲哚試驗陽性。 能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源的細菌 如產(chǎn)氣腸桿菌，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基呈堿性，使指示劑溴麝香草酚藍〔 BTB〕由淡綠轉(zhuǎn)為深藍，此為枸櫞酸鹽利用試驗陽性。 ? 生長溫度： 最適為 37℃ ， 4 ℃ 不生長 ? pH: 最適 pH為 ? 需氧性 : 需氧性很強， 厭氧條件下生長緩慢 第五十四頁，共一百三十頁。細菌在生長過程中形成色素。 耐受： 耐高濃度 NaCl－海水 ， 鹽漬醬菜中存活時間較長； 耐低溫的抵抗力較強 耐青霉素 、 磺胺嘧啶 。該菌食物中毒是致病菌對腸道的侵入和溶血毒素協(xié)同作用所致，是一種混合型食物中毒。 ?預防中毒措施 防止食品被污染 最好不食用生或半熟的海產(chǎn)品 食前徹底加熱殺菌 控制細菌繁殖 第六十頁，共一百三十頁。 ? 本標準適用于動物性水產(chǎn)干制品、腌醉制生食動物性水 產(chǎn)品、即食藻類食品、魚糜制品等 水產(chǎn)食品 和 水產(chǎn)調(diào)味 品 以及 食物中毒樣品 中副溶血性弧菌的檢驗 。 第六十七頁，共一百三十頁。 ? 本菌為需氧和兼性厭氧菌，最適生長溫度 25～ 30℃ 。 ? 本菌對熱敏感， 60℃ 30min， 65℃ 1min即可殺死。 ? ：在 25℃ 生長時不需要鈣的菌株即含 VW抗原。據(jù)檢測，豬比其他動物，如牛、羊、雞、鴨、鵝等帶菌率高，豬是此菌的主要宿主。 志賀氏菌 生長要求及培養(yǎng)特性 需氧或兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高 ? ：菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色半透明、邊緣整齊；宋內(nèi)志賀氏菌菌落一般較大，不很透明。 志賀氏菌 致病因素 ? 菌毛的作用使菌黏附于回腸末端和大腸黏膜的上皮細胞，繼而在侵襲蛋白作用下穿人上皮細胞內(nèi)； ? 內(nèi)毒素：志賀氏菌屬中各菌株都有強烈的內(nèi)毒素。 志賀氏菌 檢驗方法 ? 目前志賀氏菌檢驗 ? 多采用國標法 (GB/T )。 革蘭氏染色陽性，但衰老、 死亡或被白細胞吞噬的菌體， 常呈革蘭氏陰性。 ? 直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于 10/g〔 ml〕的食品 ? 增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。 檢樣〔 xg+9xmL稀釋液〕 適當十倍稀釋樣品 選擇 3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液， 每個稀釋度接種三管 modified Giolitti and Cantoni broth， 37℃ ， 24~48 h 從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中 接種 1環(huán)培養(yǎng)物于 BairdParker平板上 37℃ ， 48 h 確證試驗 報告 第九十三頁，共一百三十頁。 ? 一般認為土壤是肉毒梭菌的主要來源。芽孢可耐煮沸 1～ 6h，于 180℃ 干熱 5～ 15min，或 121℃ 高壓蒸汽 10～ 20min，或 100℃ 5h才能殺死芽孢， 10％鹽酸須經(jīng) 1h才能破壞，在酒精中能存活 2個月，正常胃液和消化酶于 24h不能將其破壞，可被胃腸道吸收而中毒。 肉毒素的毒性機制 ? 是一種強烈的神經(jīng)毒素，通過淋巴管和胸管進入血液循環(huán)，選擇性地作用于運動神經(jīng)與副交感神經(jīng)，主要作用點為神經(jīng)末梢和神經(jīng)肌肉交接處，抑制神經(jīng)傳導介質(zhì) 乙酰膽堿的釋放，因而使肌肉發(fā)生緩和性癱瘓。由于分泌功能障礙，患者的淚腺、汗腺及唾液腺分泌減少。 1歲以上兒童腸道內(nèi)已建立了正常微生態(tài)菌群，不利于芽孢發(fā)芽，因而不易中毒。 第一百零四頁，共一百三十頁?！灿行悠啡缤寥馈⒛嗌车雀旧喜豢赡芎卸舅?，那么應從培養(yǎng)著手〕 ③報告 (三 )：欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進行別離培養(yǎng)，對所得純菌株進行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。 肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時 ， 菌落及周圍培養(yǎng)基外表覆蓋著特有的虹彩樣 (或珍珠層樣 )薄層 。 報告 (三 )：由樣品別離的菌株為某型肉毒梭菌。 20℃ 培養(yǎng)后可見到很多鞭毛 。 ? 能抵抗亞硝酸鹽食品防腐劑；在 10％ NaCl中可生長。 ? 中毒原因 :食了入含有溶血素 O的食品。胎兒或嬰兒的感染多半來自母體中的細菌或帶菌的乳制品。 單核細胞增生李斯特氏菌選擇性別離培養(yǎng) OXA瓊脂 FDA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。 第一百二十一頁，共一百三十頁。 有黑色的暈輪并且中間凹陷。 第一百一十七頁，共一百三十頁。 ? 中毒機理：該菌隨食物攝入后，在腸道內(nèi)很快繁殖，入侵各局部組織 (包括孕婦的胎盤 )，進入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過血流到達其他敏感的體細胞，并在其中繁殖，利用溶血素 O的溶解作用逃逸出吞噬細胞，并利用兩種磷脂酶的作用 (分解細胞膜磷脂分子的頭部極性基團 )在細胞間轉(zhuǎn)移，引起炎癥反響。 ? 對多種抗生素敏感，以氨芐青霉素加上一種氨基糖苷抗生素為特效治療藥，對磺胺、多黏菌素等具耐藥性 第一百一十四頁，共一百三十頁。 培養(yǎng)特性： 生長溫度為 2~42℃ 〔冷藏不能阻止該菌的生長〕，最適生長溫度為 35~37℃ 。 第一百一十頁，共一百三十頁。 〔 3〕別離培養(yǎng) 〔 1〕毒素檢測：試驗方法同上。 〔 1〕肉毒毒素檢測 注射液中假設有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后 24 h內(nèi)發(fā)病、死亡 液態(tài)或固體〔明膠磷酸鹽緩沖液〕樣品經(jīng)過適當處理后離心，取上清液實驗 上清液及其胰酶激活處理液 分別進行小白鼠腹腔注射，各 3只，每只 mL，觀察 4 d 確證試驗 毒力測定 定型試驗 第一百零七頁，共一百三十頁。 試劑： 肉毒分型抗毒診斷血清、胰酶〔活力 1:250〕、革蘭氏染色液。 ? 污染途徑 : ? 土壤為重要污染源。病死率為 25％～ 44％。此蛋白主要負責運輸神經(jīng)介質(zhì)，經(jīng)內(nèi)切酶 (即毒素 )作用后，即毒素作用于膽堿能神經(jīng)末梢的突觸，通過毒素的重鏈與突觸前膜毒素受體 — 神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合，肽鏈被切斷，不能識別神經(jīng)介質(zhì)，失去了運輸神經(jīng)介質(zhì)的能力，從而抑制乙酰膽堿的釋放，阻礙神經(jīng)沖動的傳導而引起肌肉松弛性麻痹和神經(jīng)功能不全。對明膠、凝固