【正文】 TCT A 2. DNA聚合酶 Ⅰ （全酶） DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA pol Ⅰ ） 是一個具有 3 種酶活性的多功能性酶。 克隆和進(jìn)行基因操作需要對遺傳物質(zhì)進(jìn)行剪切、修飾和連接，這些過程都是在工具酶的催化下完成的。 （三）、基因工程的研究內(nèi)容 二、基因工程相關(guān)概念及基本工具 克隆指同一副本或拷貝集合。 Lederberg開始從事細(xì)菌性因子（ F因子）研究?；蚬こ讨扑? 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 基因工程基本技術(shù)與策略 第三節(jié) 基因藥物生產(chǎn)的基本過程 第四節(jié) 基因工程藥物制造實(shí)例 第一節(jié) 概述 一、基因工程建立的基礎(chǔ) 二、基因工程的相關(guān)概念及相關(guān)酶學(xué) 三、基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物 四、基因工程制藥的優(yōu)點(diǎn) 五、基因工程制藥所使用的生物技術(shù) 六、我國基因工程制藥的進(jìn)展 七、基因工程制藥生產(chǎn)的化學(xué)工藝學(xué)要求 八、基因工程的發(fā)展 一、基因工程建立的基礎(chǔ) （一）、理論方面的三個重要的發(fā)現(xiàn) — DNA的發(fā)現(xiàn) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理的建立 1953年，沃森 (Watson） 和克里克 （ Crick） 首次提出了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。 20世紀(jì) 5060年代，相繼發(fā)現(xiàn)其他質(zhì)粒，如抗藥性基因（ R因子）和大腸桿菌因子（ CoE）。從眾多不同的分子群體中分離的某一感興趣分子，經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生很多相同分子集合，即為分子克隆。按功能將工具酶分類， 可分為 剪切酶類、 連接酶類和修飾酶類 如下所示 分子剪刀和分子針線 （二）、基因工程的工具酶 (restriction endonuclease, RE) (1) 定義 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別和 切割雙鏈DNA中的特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶，簡稱 限制酶或 切割酶 。 包括： 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ 核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ 核酸外切酶活性 DNA pol Ⅰ 應(yīng)用 ⑴ 常用來 催化 DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性 DNA 探針 ； ⑵ cDNA第二條鏈的合成； ⑶ 對 DNA3?突出末端進(jìn)行標(biāo)記； ⑷ DNA序列分析。 339。 339。339。339。 6. DNA連接酶 (DNA ligase) 催化雙鏈 DNA中一條鏈的 3’ OH與另一條鏈的 5’ PO3H2形成磷酸二酯鍵 ， 從而構(gòu)成完整的 DNA長鏈 。 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 （ Ⅱ 型） 識別特異堿基序列，切割 DNA T4 DNA連接酶 催化 DNA5’ 磷酸與 3’ 羥基 形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以 DNA為模板合成 DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 以 RNA為模板合成 cDNA 堿性磷酸酶 切除 5’ 末端磷酸 末端轉(zhuǎn)移酶 催化 3’ 端合成同聚尾 基因工程的載體是為“攜帶”感興趣的外源 DNA、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 基因克隆載體必須具備三個條件 松弛型的復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、 篩選標(biāo)記 . 常見 :質(zhì)粒、噬菌體 ◆ 克隆載體必需結(jié)構(gòu) : 具有 復(fù)制子 ， 篩選標(biāo)記 ，位于多克隆位點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的 啟動子 ，起始密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn) ， 轉(zhuǎn)錄終止子 結(jié)構(gòu)． ◆ 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 三、基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物 傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì)和多肽類，包括： （ 1） 免疫蛋白質(zhì) 各種抗原、單克隆抗體、乙肝疫苗。 五、基因工程制藥所使用的生物技術(shù) （ 1） DNA重組技術(shù) （ 2）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù) （ 3）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （ 4）克隆表達(dá)技術(shù) 六、我國基因工程制藥的進(jìn)展 α 1b型基因工程干擾素 ，是我國自行研究開發(fā)的具有國際先進(jìn)水平的基因工程藥物，于 1997年通過 III期臨床，并獲得國家 一類新藥證書 。 ? 2023年 4月 14日 公布人類基因組基本信息。此時細(xì)胞經(jīng)過熱脈沖發(fā)生收縮作用，細(xì)胞膜出現(xiàn)間隙，此時質(zhì)粒 DNA可通過進(jìn)入細(xì)胞。 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的 超螺旋 構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率要比新制備的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。 載體： 編碼 β 半乳糖 宿主： 編碼 β 半乳糖 苷酶 N端 序列 苷酶 C端 序列 α 互補(bǔ) 細(xì)菌表達(dá)： β 半乳糖苷酶活性 ↑ 5溴 4氯 3吲哚 （ Xgal） → 形成 藍(lán)色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中 插入外源 DNA→β 半乳糖苷酶的 N端基因失活 → 不能與宿主 β半乳糖苷酶的 C端 進(jìn)行 α 互補(bǔ) → 產(chǎn)生 白色菌落 。 缺點(diǎn)：假陽性高。 DNA同源序列之間