分子生物學(xué)基本技術(shù)—pcr(polymerasechainreaction)(完整版)
【正文】 ? Primes（引物）： 每條引物的濃度 ～ 1umol或 10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，增加二聚體的機會。 ? 1988年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA聚合酶。 ? 1993年： Mullis與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”加拿大籍英國科學(xué)家 Michael Smith共獲諾貝爾化學(xué)獎 Kary Mullis Michael Smith 穆利斯（ Kary Mullis） 美國化學(xué)家 1944～ 史密斯（ Michael Smith） 加拿大化學(xué)家 1932～ 二、 PCR的基本原理 ?PCR的基本原理： 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 ? PCR三步曲 Three steps： Denaturation 變性 90～ 97℃ Primer annealing 退火 45～ 55℃ Polymerization 延伸 72℃ 原 理 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ 類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制。純化引物在 25％乙腈溶液中 4℃ ；凍干引物于 20℃ 可保存12年，液體狀態(tài)于 20℃ 可保存 6個月。 ? Buffer： 1050mmol/L TrisHCl(, 20℃ )。 退火 (復(fù)性 )溫度與時間 ? 引物中 G、 C含量高、 長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。一般： 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時間 1min是足夠 的 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min 10Kb需延伸至 15min。 ? ： DNA 粗制品及總 RNA均可作為擴增模板。 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈 (內(nèi)部寡核苷酸 )標記后做探針，與 PCR產(chǎn)物雜交。 RAPD易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，敏感性高。 （三） AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism) ? 基本原理： ?結(jié)合了 RFLP和 PCR技術(shù)的特點 ，具有 RFLP技術(shù)的可靠性和 PCR 技術(shù)高效性。 ?核酸序列分析 是檢測 PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 七、 PCR產(chǎn)物的分析 ? 凝膠電泳分析 通常應(yīng)用 1～ 2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。通常 3755℃ 、 12分鐘。 分離 : 1969年，美國黃石國家公園溫泉 分子量 : 94KDa 活性： 在幾種水生棲熱菌中活性最高， 200 000U/mg 離子需要： 對 Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較敏感。 ? dNTPs： dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴增效率有密切關(guān)系，多次凍融會使 dNTP降解。 這種熱變性 復(fù)性 延伸的過程就是一個PCR循環(huán)， PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 ? 但由于測序和引物合成的困難 ， 以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基
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