【正文】 （ transmission electron microscope, TEM） 1. 原理 ◆ 以電子束作光源，電磁場作透鏡 。 戊二醛：在蛋白質(zhì)分子之間形成共價鍵 , 將它們交聯(lián)在一起。重金屬浸染。 隨樣品表面結(jié)構(gòu)的高低起伏，重金屬形成不同厚度的薄膜，顯示了投影效果，給出了一個樣品表面結(jié)構(gòu)的三維圖像。 第二節(jié) 細(xì)胞組分的分離及分析技術(shù) 一、細(xì)胞組分的分離 ——離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段 。 （二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。 原理： 樣品各成分在 連續(xù)梯度的介質(zhì) 中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。 2. Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使 Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。常用 3HTdR來顯示 DNA，用 3HUdR顯示 RNA；用 3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、 3H巖藻糖研究多糖。 人類染色體端粒 DNA的熒光原位雜交照片 （二） Southern雜交 是 體外分析特異 DNA序列的方法 ，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核 DNA或線粒體 DNA切成 DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可 辨認(rèn)出與探針互補的特殊核苷序列 。 細(xì)胞電泳 原理： 在一定 pH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 小鼠胚胎肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿霉素處理后 DNA損傷情況 對照組 100ng/ml阿霉素 200ng/ml阿霉素 （一）免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。 有限細(xì)胞系 永生化細(xì)胞系 細(xì)胞株（ cell strain） ：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 異核體 ：不同基因型的細(xì)胞融合而成。 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。 ?透射電鏡及掃描電鏡技術(shù)的原理及成像特點。我國著名學(xué)者童第周等在魚類細(xì)胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。 誘發(fā)融合 ：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。 免疫熒光法 （ immunofluorescent technique） ：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 用途： 檢測細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞，如分離哺乳動物的 XY精子。 PCR： polymerase chain reaction 反應(yīng)體系： ①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時間在95℃ 下不失活。 四、顯微光譜分析技術(shù) 細(xì)胞中一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收譜線。 3. 聯(lián)苯胺反應(yīng) ：過氧化物酶分解 H202，產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。 2）所需的力場通常比速率沉降法大 10～ 100倍，往往需要高速或超速離心。 常用介質(zhì)： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 轉(zhuǎn)速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機 。聚焦電子束與試樣相互作用，產(chǎn)生二次電子發(fā)射。 應(yīng)用： 適用于顆粒或纖維等游離的樣品。 (3)脫水 ：標(biāo)本必須置于高真空中進行電鏡觀察 ,所以電鏡生物標(biāo)本不能含水。 ◆由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等 5部分構(gòu)成。只有從樣品發(fā)出的散射光才能進入物鏡被放大 ,在暗的背景中呈現(xiàn)明亮的像。 ⑶ 應(yīng)用 : 5. 綠色熒光蛋白 green fluorescent protein GFP 載體 (GFP基因＋待定位蛋白基因 ) 導(dǎo)入特定的細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察 待定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置分布 特異蛋白質(zhì)生物大分子定位 觀察過氧化物酶體 GFP ＋過氧化物體內(nèi)的酶（有定位信號） 導(dǎo)入不同細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察各種細(xì)胞的過氧化物酶體 （三）激光共聚焦掃描顯微鏡 （ Laser confocal scanning microscope, LCSM） 顯微 CT 激光作掃描光源 掃描焦平面上樣品，得樣品切面像 載物臺上微量步進馬達使載物臺上下移動 ,改變焦平面 得不同層次的切面圖像 計算機圖像三維重組獲樣品立體圖像 分辨率：因激光束波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨率，約是普通光鏡的 3倍。 ： A 光源 B 二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線 C 一組濾光片：得到純的激發(fā)光和發(fā)射光 熒光顯微鏡光路圖 3. 熒光的觀察