3-第三章(存儲(chǔ)版)
【正文】 術(shù)的原理與應(yīng)用。 模式生物通常具有個(gè)體小、容易培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快等特點(diǎn)。 （二）單克隆抗體技術(shù) 正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。 3. 原生質(zhì)體培養(yǎng)： 培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)： – ① 比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如 DNA； – ② 便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞； – ③ 適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。 七、免疫學(xué)方法對(duì)細(xì)胞組分的分析 （二）免疫電鏡技術(shù) Gold particles coated with protein A are used to detect an antibodybound protein by transmission electron microscopy. （三）免疫印跡 ——Western blotting 技術(shù) 八、其它生化分析方法 ——X射線晶體衍射 ——電泳、層析、色譜等 第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞工程 一、細(xì)胞培養(yǎng) （一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng) （ mass culture） ：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（ confluence） 后形成均勻的單細(xì)胞層； 克隆培養(yǎng) （ clonal culture） ：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。如果細(xì)胞未受損傷，電泳中核 DNA因其分子量大停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無(wú)拖尾現(xiàn)象。 反應(yīng)過(guò)程 ：①變性：約 9095℃ ；②復(fù)性：約 60℃ 左右；③延伸： 7075℃ ；④重復(fù)“變性 復(fù)性 延伸” 過(guò)程 2030次循環(huán)。 五、分子雜交技術(shù) 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成 DNADNA，DNARNA或 RNARNA雜交的雙鏈分子。 5. 茚三酮反應(yīng) ：顯示蛋白質(zhì)。 （一）固定 1. 物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。 速度沉降 velocity sedimentation 用途 ：分離 密度相近而大小不等 的細(xì)胞或細(xì)胞器。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點(diǎn)： ——介質(zhì)密度均一； ——速度由低向高，逐級(jí)離心。 Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For parison, the same structure is shown by differentialinterferencecontrast light microscopy (B) and by thinsection electron microscopy (C). 蛙的內(nèi)耳毛細(xì)胞 （三）掃描隧道顯微鏡 （ scanning tunneling microscope， STM） 原理： 根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在一定高度（ 100nm以內(nèi)）上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（ 2mV~2V），針尖與樣品之間形成 隧道電流 。 （ 1）負(fù)染技術(shù) 冰凍蝕刻 freezeetching 標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。 (4)包埋 ：為使柔軟生物組織制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊，應(yīng)在切片前將標(biāo)本進(jìn)行包埋 ,常用 環(huán)氧樹脂 。 ◆用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ ultrastructure），即小于 、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu)， 又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（ submicroscopic structures）。用以觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體 , 以及液體介質(zhì)中的細(xì)菌等微粒的運(yùn)動(dòng) 。 3. 原理 : 波長(zhǎng) 顏色 振幅 亮度 速度 相位 ⑴ 普通顯微鏡 : 光通過(guò)染色標(biāo)本時(shí)，波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人眼才能觀察到。 帶熒光標(biāo)記的抗體與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，這樣就能通過(guò)抗體結(jié)合的熒光觀察到抗原。 幾種介質(zhì)的折射率 顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn) 觀察標(biāo)本的制備： 復(fù)水 ↓ 染色 ↓ 脫水 ↓ 透明 ↓ 封片 ↓ 觀察 取材 ↓ 固定 ↓ 脫水 ↓ 包埋 ↓ 切片 ↓ 脫蠟 第一步 . 固定 (fixation) 目的：使大分子交聯(lián)而保持固定，不至在后面過(guò)程中移位或丟失。 （ 3）數(shù)值孔徑： 令 N （ 1） 分辨率： 顯微鏡能分辨的最小距離，用 D表示。 試劑：蠟、樹脂 機(jī)理：可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，起支持作用。 ⑵熒光素標(biāo)記抗體的方法 ①直接法：熒光素直接和第一抗體偶聯(lián)。相差顯微鏡能夠把這種 “相位差” 變成 “振幅差” ，即圖像的明暗差。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過(guò)另一棱鏡將這兩束光會(huì)合，從而樣品中厚度上的微小區(qū)別就會(huì)轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且極有很強(qiáng)立體感，適于研究細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 2. 透射電鏡生物標(biāo)本制作：
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