3-第三章(文件)
【正文】 一定 pH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。如果細胞未受損傷，電泳中核 DNA因其分子量大停留在核基質中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團，無拖尾現(xiàn)象。 小鼠胚胎肝細胞經(jīng)不同濃度阿霉素處理后 DNA損傷情況 對照組 100ng/ml阿霉素 200ng/ml阿霉素 （一）免疫細胞化學 immunocytochemistry 根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。 七、免疫學方法對細胞組分的分析 （二）免疫電鏡技術 Gold particles coated with protein A are used to detect an antibodybound protein by transmission electron microscopy. （三）免疫印跡 ——Western blotting 技術 八、其它生化分析方法 ——X射線晶體衍射 ——電泳、層析、色譜等 第三節(jié) 細胞培養(yǎng)及細胞工程 一、細胞培養(yǎng) （一）動物細胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng) （ mass culture） ：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（ confluence） 后形成均勻的單細胞層； 克隆培養(yǎng) （ clonal culture） ：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。 有限細胞系 永生化細胞系 細胞株（ cell strain） ：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。 3. 原生質體培養(yǎng)： 培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點： – ① 比較容易攝取外來的遺傳物質，如 DNA； – ② 便于進行細胞融合，形成雜交細胞； – ③ 適宜條件下可產生細胞壁，經(jīng)誘導分化成完整植株。 異核體 ：不同基因型的細胞融合而成。 （二）單克隆抗體技術 正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。 顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。 模式生物通常具有個體小、容易培養(yǎng)、操作簡單、生長繁殖快等特點。 ?透射電鏡及掃描電鏡技術的原理及成像特點。 ?決定顯微鏡分辨率的參數(shù)有哪些？提高顯微鏡分辨率的途徑有哪些？ ?免疫熒光顯微術的原理與應用。我國著名學者童第周等在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。 （三）顯微注射技術 尼康 NT88NE顯微操作 /注射儀 顯微操作技術（ micromanipulation technique）是指在高倍復式顯微鏡下，利用顯微操作器（ micromanipulator）進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。 誘發(fā)融合 ：異種間的細胞必須經(jīng)誘導劑處理才能融合。 二、細胞工程 （一）細胞融合 通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為 細胞融合（ cell fusion）或細胞雜交。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。 細胞系（ cell line） ：具有特定生物學與遺傳學特征，且能在體外穩(wěn)定永久生生長的細胞群體。 免疫熒光法 （ immunofluorescent technique） ：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。只有當 DNA雙鏈斷裂 (DSBs)時，其斷片進入凝膠中，電泳時斷片向陽極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星。 用途： 檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細胞，如分離哺乳動物的 XY精子。 原理： 包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達 99%。 PCR： polymerase chain reaction 反應體系： ①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時間在95℃ 下不失活。 （一）原位雜交 （ in situ hybridization） 用于檢測染色體上的特殊 DNA序列。 四、顯微光譜分析技術 細胞中一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收譜線。 原理： 將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 3. 聯(lián)苯胺反應 ：過氧化物酶分解 H202，產生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。 2）所需的力場通常比速率沉降法大 10～ 100倍，往往需要高速或超速離心。 特點 ：介質密度較低， 介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度 。 常用介質： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 沉降順序： 核 →線粒體 →溶酶體與過氧化物酶體 →內質網(wǎng)與高基體 →核蛋白體。 轉速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機 。 分辨
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