3-第三章(文件)
【正文】 一定 pH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)。如果細(xì)胞未受損傷，電泳中核 DNA因其分子量大停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無(wú)拖尾現(xiàn)象。 小鼠胚胎肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿霉素處理后 DNA損傷情況 對(duì)照組 100ng/ml阿霉素 200ng/ml阿霉素 （一）免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。 七、免疫學(xué)方法對(duì)細(xì)胞組分的分析 （二）免疫電鏡技術(shù) Gold particles coated with protein A are used to detect an antibodybound protein by transmission electron microscopy. （三）免疫印跡 ——Western blotting 技術(shù) 八、其它生化分析方法 ——X射線晶體衍射 ——電泳、層析、色譜等 第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞工程 一、細(xì)胞培養(yǎng) （一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng) （ mass culture） ：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（ confluence） 后形成均勻的單細(xì)胞層； 克隆培養(yǎng) （ clonal culture） ：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。 有限細(xì)胞系 永生化細(xì)胞系 細(xì)胞株（ cell strain） ：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 3. 原生質(zhì)體培養(yǎng)： 培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)： – ① 比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如 DNA； – ② 便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞； – ③ 適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。 異核體 ：不同基因型的細(xì)胞融合而成。 （二）單克隆抗體技術(shù) 正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。 模式生物通常具有個(gè)體小、容易培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快等特點(diǎn)。 ?透射電鏡及掃描電鏡技術(shù)的原理及成像特點(diǎn)。 ?決定顯微鏡分辨率的參數(shù)有哪些？提高顯微鏡分辨率的途徑有哪些？ ?免疫熒光顯微術(shù)的原理與應(yīng)用。我國(guó)著名學(xué)者童第周等在魚(yú)類細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作，并取得了豐碩成果。 （三）顯微注射技術(shù) 尼康 NT88NE顯微操作 /注射儀 顯微操作技術(shù)（ micromanipulation technique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器（ micromanipulator）進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。 誘發(fā)融合 ：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。 二、細(xì)胞工程 （一）細(xì)胞融合 通過(guò)培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程稱為 細(xì)胞融合（ cell fusion）或細(xì)胞雜交。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無(wú)性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。 細(xì)胞系（ cell line） ：具有特定生物學(xué)與遺傳學(xué)特征，且能在體外穩(wěn)定永久生生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。 免疫熒光法 （ immunofluorescent technique） ：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。只有當(dāng) DNA雙鏈斷裂 (DSBs)時(shí)，其斷片進(jìn)入凝膠中，電泳時(shí)斷片向陽(yáng)極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星。 用途： 檢測(cè)細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞，如分離哺乳動(dòng)物的 XY精子。 原理： 包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá) 99%。 PCR： polymerase chain reaction 反應(yīng)體系： ①樣品 DNA；②引物（ primer），約 1520個(gè)核苷酸；③ 4種 dNTP；④ Tag DNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌 Thermus aquaticus，最適作用溫度 75~80℃ ，短時(shí)間在95℃ 下不失活。 （一）原位雜交 （ in situ hybridization） 用于檢測(cè)染色體上的特殊 DNA序列。 四、顯微光譜分析技術(shù) 細(xì)胞中一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收譜線。 原理： 將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 3. 聯(lián)苯胺反應(yīng) ：過(guò)氧化物酶分解 H202，產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。 2）所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大 10～ 100倍，往往需要高速或超速離心。 特點(diǎn) ：介質(zhì)密度較低， 介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 。 常用介質(zhì)： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 沉降順序： 核 →線粒體 →溶酶體與過(guò)氧化物酶體 →內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體 →核蛋白體。 轉(zhuǎn)速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機(jī) 。 分辨
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