3-第三章-在線瀏覽
2024-09-14 08:44本頁面
【正文】 （一）普通光學(xué)顯微鏡 原理 ： 經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。 光學(xué)顯微鏡的放大原理和光路圖 普通光學(xué)顯微鏡光路圖 主要的性能參數(shù) （ 2）孔徑角 ： 由標本上一點發(fā)出的進入物鏡最邊緣光線 L和進入物鏡中心光線 OA之間的夾角 ?/2稱為孔徑角。A = nsin (?/2), 叫物鏡的數(shù)值孔徑。 （ 1） 分辨率： 顯微鏡能分辨的最小距離，用 D表示。 D= / nsin (?/2) D：分辨率 λ :光波的波長 n:介質(zhì)折射率 α :物鏡鏡口角 (標本在光軸的一 點對于物鏡鏡口的張角 ) ——sinα/2 的最大值必然小于 1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為 ～ ；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近 。 ——制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為 ～ ，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 試劑：甲醛、戊二醛 機理：可與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，將鄰近蛋白分子交聯(lián)。 試劑：蠟、樹脂 機理：可進入細胞內(nèi)，起支持作用。 儀器：切片機 切片厚度： 1～ 10 ?m 第五步 .染色（ staining） 目的：使細胞成為可見 . 方法： 蘇木精－細胞內(nèi)核酸的分布 伊 紅－細胞質(zhì)染色 酶 + 底物 抗原 + 抗體 可見光 紫外光 紅外光 short long λ （二）熒光顯微鏡 (Fluorescence microscope) 1. 原理 : 熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長的短波光線，并發(fā)射出比原來吸收波長更長的光。 非熒光性物質(zhì)用熒光色素染色后，可產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便于進行觀察 。 圖示： 鼠主動脈平滑肌的熒光染色。 ⑵熒光素標記抗體的方法 ①直接法：熒光素直接和第一抗體偶聯(lián)。 4. 免疫熒光顯微鏡技術(shù) （ Immunofluorescence microscopy） ⑴ 發(fā)光原理 : 藍色光 GFP 綠色熒光 ⑵ 特點 : 可在光鏡水平 ， 對特異蛋白質(zhì)等生物大分子進行定位及顯示一些細胞超微結(jié)構(gòu) 。 應(yīng)用： 觀察細胞形態(tài) 統(tǒng)計光密度來定量細胞內(nèi)成分 三維重建 （四）相差顯微鏡 1. 1953年諾貝爾物理獎 2. 特點 : 可用以觀察活細胞。但光通過活細胞時，波長和振幅幾乎無改變，這就無法用人眼觀察。相差顯微鏡能夠把這種 “相位差” 變成 “振幅差” ，即圖像的明暗差。 —— 制造暗視野顯微鏡的靈感 （五）暗視野顯微鏡 原理 : 利用特殊裝置使照射光斜照到樣品上，照射光無法進入物鏡，故呈暗視野。 分辨率： 典型的動物細胞 ——— 10～ 20 ?m 一般的細菌和線粒體 —— ?m (500nm) 普通顯微鏡 ———— (200nm) 暗視野顯微鏡 ———— (4200nm) 應(yīng)用： 能觀察物體輪廓 ,分不清內(nèi)部的微細結(jié)構(gòu)。 顯微電影攝影 —記錄細胞或細胞器運動過程和速度 用顯微電影攝影術(shù)或電視錄像以一定間隔拍攝一次細胞狀態(tài)，當(dāng)影片或電視錄像以正常速度反映時，所拍攝的情節(jié)就被大大加快了，用這種方法可以準確地記錄細胞或細胞其的運動過程和速度。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光會合，從而樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且極有很強立體感，適于研究細胞中較大的細胞器。電子束波長短，且波長與加速電壓 (通常為 50~120KV)的平方根成反比。 分辨力 ，放大倍數(shù)可達百萬倍。 透射電鏡 光學(xué)顯微鏡 電子束通過標本時，根據(jù)標本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。 2. 透射電鏡生物標本制作： ⑴ 取材 ⑵ 固定 ：防止產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。 四氧化鋨：除與蛋白共價結(jié)合外，還對脂類有良好的固定效果。梯度乙醇。 (5)切片 ：電子穿透力很弱 ,需將樣品制成 50～ 100nm厚薄片。 (6)染色 ：生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成，它們散射電子能力弱 ,在電鏡下幾乎不存在明暗反差 ,需加大生物樣品反差，進行染色。 透射電鏡提高樣品反差的方法 原理： 用只 沉積于樣品周圍的、 比樣品密度高的物質(zhì) (如磷鎢酸 )對樣品進行染色， 使樣品和背景形成顯著的明暗對比 ,這種染背景而不染樣品的方法叫負染 。特別是在病毒性致病因子的超微病理診斷中廣泛應(yīng)用。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（ replica）。 電鏡三維重建技術(shù) （二）掃描電子顯微鏡 （ Scanning electron microscope， SEM） 掃描電鏡的成像原理 陰極鎢絲加熱后產(chǎn)生的電子束經(jīng)過柵極和陽極加速和會聚，再經(jīng)二級聚光鏡及物鏡會聚形成 具有一定能量、一定束流強度和束斑直徑的微細電子束； 電子束在掃描線圈驅(qū)動下，在試樣表面按一定時間、空間順序作柵網(wǎng)式掃描。 二次電
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