3-第三章-文庫吧在線文庫
【正文】 ⑴ 取材 ⑵ 固定 ：防止產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。 (6)染色 ：生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成，它們散射電子能力弱 ,在電鏡下幾乎不存在明暗反差 ,需加大生物樣品反差，進(jìn)行染色。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（ replica）。 用途： 三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。 可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。 isopyic sedimentation 用途： 分離 密度不等 的顆粒。 （二）顯示方法 二、細(xì)胞組分的化學(xué)染色 1. 金屬沉淀法 ：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成 CoS或 PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。 一般用 14C和 3H標(biāo)記。最初是使用帶放射性的 DNA探針，后來又發(fā)明了熒光探針法。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞儀（ flow cytometer）。 用途： 檢測單細(xì)胞水平的 DNA損傷 。通?？蓙碜阅[瘤組織的細(xì)胞群或培養(yǎng)中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 同核體 ：相同基因型的細(xì)胞融合而成。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置。 ?流式細(xì)胞技術(shù)的原理及應(yīng)用。 第四節(jié) 模式生物 由于基因在進(jìn)化上的保守性和遺傳密碼的通用性，從一種實(shí)驗生物得到的有關(guān)基因性質(zhì)或功能方面的信息通常也適用于其他生物。 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法 ：生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇 PEG）、物理方法（電擊和激光）。 2. 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)： 適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。 酶標(biāo)免疫法 （ enzymelabeled antibody method） ：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。 單細(xì)胞凝膠電泳 ——單細(xì)胞水平的 DNA損傷檢測 原理： 真核 細(xì)胞的 DNA分子量很大， DNA超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)中，該方法用瓊脂糖凝膠將細(xì)胞包埋在載玻片上，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜及其它生物膜破壞，細(xì)胞內(nèi)的 RNA、蛋白質(zhì)及其它成分進(jìn)入凝膠，繼而擴(kuò)散到裂解液中，唯獨(dú)核 DNA仍保持纏繞的環(huán)區(qū)(Loop)附著在剩余的核骨架上，并留在原位。⑤緩沖體系和 Mg2+。 可利用顯微分光光度計對某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測定。 4. 脂溶染色法 ：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法 （ histochemical and cytochemical staining method）用于對某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。 分離活細(xì)胞的 介質(zhì)要求 ： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2） pH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細(xì)胞無毒。 目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá) 100000r/min。 二次電子發(fā)射量隨試樣表面形貌而變化 ； 二次電子信號被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。特別是在病毒性致病因子的超微病理診斷中廣泛應(yīng)用。梯度乙醇。 分辨力 ，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 分辨率： 典型的動物細(xì)胞 ——— 10～ 20 ?m 一般的細(xì)菌和線粒體 —— ?m (500nm) 普通顯微鏡 ———— (200nm) 暗視野顯微鏡 ———— (4200nm) 應(yīng)用： 能觀察物體輪廓 ,分不清內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用： 觀察細(xì)胞形態(tài) 統(tǒng)計光密度來定量細(xì)胞內(nèi)成分 三維重建 （四）相差顯微鏡 1. 1953年諾貝爾物理獎 2. 特點(diǎn) : 可用以觀察活細(xì)胞。 非熒光性物質(zhì)用熒光色素染色后，可產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便于進(jìn)行觀察 。 ——制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為 ～ ，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 光學(xué)顯微鏡的放大原理和光路圖 普通光學(xué)顯微鏡光路圖 主要的性能參數(shù) （ 2）孔徑角 ： 由標(biāo)本上一點(diǎn)發(fā)出的進(jìn)入物鏡最邊緣光線 L和進(jìn)入物鏡中心光線 OA之間的夾角 ?/2稱為孔徑角。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。 第四步 . 切片（ section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在載玻片上進(jìn)行染色。 ②間接法：熒光素先和第二抗體 (抗第一抗體的抗體 )偶聯(lián)，再與第一抗體作用。 通過致密部分 (如細(xì)胞核 ),速度慢 通過疏松部位 (如細(xì)胞質(zhì) ),速度快 相位差 (光程差 ) 振幅差 (明暗差 ) 相差顯微鏡 倒置相差顯微鏡 載物臺的上方： 光源 長焦距 聚光器 載物臺的下方： 物鏡 應(yīng)用：直接對培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行觀察 培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞 活細(xì)胞的有絲分裂 在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒塵土是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束從光線從門縫斜射過來，灰塵便粒?？梢娏?，這是光學(xué)上的 丁達(dá)爾現(xiàn)象 。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理圖 （七）熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（ FRET） （八）熒光漂白恢復(fù)技術(shù) (FRAP) 熒光漂白恢復(fù)技術(shù)原理圖 二、電子顯微鏡 （一）透射電子顯微鏡
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